Molekulare Zellbiologie II (Zytologie)

· peroxisomale Signal-Sequenz

· Ablauf des Proteinimports:

  · Protein bindet an cytosolischen Rezeptor (→ Unterschied zum mitochondrialen Import)

  · Rezeptor bindet mit Protein an ein peroxisomales Membranprotein

  · Protein wird über ein Translokationskomplex in das Peroxisom eingeschleust

→ bei einer Fehlfunktion kommt es zum "Zellweger Syndrom" → Fettsäuren werden nicht mehr abgebaut

  → Multi-Organ-Versagen

· nukleäre Signal-Sequenz

· Ablauf des Proteinimports:

  1.  Protein bindet an Rezeptor

  2.  aktiver Transport von Protein + Rezeptor durch die Kernporen

  3.  Ran-GTP bindet an Rezeptor → Protein dissoziiert vom Rezeptor

  4.  Rezeptor-GTP-Komplex verlässt Zellkern

  5.  GTP wird hydrolisiert und GDP dissoziiert vom Rezeptor

· lysosomale Signal-Sequenz

· Cystinosin (Transporter der lysosomalen Membran)

  · exportiert Cystin (H+ gesteuert)

  · bei Fehlfunktion kommt es zu Cystinose

  · Typische Sequenz am C-Terminus (liegt im Cytoplasma):   -Gly-Tyr-X-X-  /  -G-Y-X-X-

1.  Proteinsynthese am rER

2.  Aufnahme des Proteins ins ER

3.  Sortierung im Golgi-Apparat

4a. Abgabe über Transportvesikel nach extrazellulär

4b. Aufnahme ins Endosom und Abgabe ins Lysosom

· Proteine besitzen eine AS-Sequenz mit einem hydrophoben Block am N-Terminus

· Proteine können bereits während der Synthese ins ER aufgenommen werden

· wasserlösliche Proteine werden ganz ins Lumen aufgenommen (s. unten)

· transmembrane Proteine werden in die ER-Membran eingelagert (komplexer Vorgang)

· Prinzip der Aufnahme von wasserlöslichen Proteinen:

  1.  ER-Signalsequenz wird vom SRP (Signal-recognition particle / verlangsamt Proteinsynthese) gebunden

  2.  SRP bindet an Rezeptor in der ER-Membran

  3.  SRP-Rezeptor bindet an einen Translokations-Kanal

  4.  Signal-Sequenz des Proteins bindet an Translokations-Kanal und öffnet diesen (GTP-Verbrauch)

  5.  SRP dissoziiert vom Protein → Proteinsynthese läuft wieder normal ab

  6.  Protein wird direkt ins ER-Lumen synthetisiert

  7.  Signalsequenz wird von einer Signal-Peptidase abgeschnitten → Kanal wird geschlossen

STA = Internal Stop-Transfer Anchor Sequence (nie mit SA verbunden / hydrophob / stopt Translokation)

SA  = Internal Signal-Anchor Sequence (immer mit positiven AS verknüpft)

+++ = positive AS-Reste (immer auf cytosolischer Seite / mit SA verknüpft)

· zu Lernen: Typ I / II / III

· Beispiele:

  · Na⁺/K⁺ - ATPase  (Typ I / Typ II / Multipass)

  · GPI-verankerte Proteine

· Bildung von Disulfidbrücken

  · Cystein wird oxidiert durch PDI (protein disulfide isomerase / kann zu ROS führen)

  · Disulfidbrücken tragen zur Stabilität und Resistenz gegenüber pH und Enzymen bei

· Glykosylierung

  · ER-Enzyme (OPT / oligosaccharide protein transferase)

  · Oligosaccharid wird über N-Acetylglucosamin an Asn angehängt (Sequenz: -Asn-X-Ser- oder -Asn-X-Thr-)

     · Oligosaccharid besteht aus 3x Glucose / 9x Mannose / 2x N-Acetylglucosamin → 14 Zucker

     · für Transport in Golgi wird 3x Glucose und 1x Mannose abgeschnitten → nur noch 10 Zucker

     · die ersten 7 Zucker werden cytosolisch auf Dolichol-Phosphat aufgebaut, bevor das Oligosaccharid ins Lumen "flipt"

  · ermöglicht Schutz / Transportsignal / Erkennungssignal

  · 50% aller Proteine sind glykosyliert

· Proteolyse

1.  es werden einige Mannose-Zucker vom Oligosaccharid abgespalten

2.  in der "terminalen Glykosylierung" werden komplexe Strukturen angehängt

· O-linked glycosylation

  · findet im cis-Golgi statt (nach der N-Glykosylierung und der Proteinfaltung)

  · Glykane werden an O-Atome von Serin und Threonin (und Hydroxylysin / -prolin) angehängt

  · wichtig für den Proteintransport

1.  Preproinsulin aus mRNA im Pankreas wandert in das ER

2.  Signal-Sequenz wird abgeschnitten und Disulfidbrücken werden gebildet → Proinsulin

3.  Endonuklease im Golgi schneidet 31 Aminosäuren heraus → Insulin

4.  Insulin reift in den endokrinen Zellen der Langerhans-Inseln aus

5.  Signalsequenz wird verpackt und recycled

6.  bei einer Stimulation der β-Zellen wird Insulin ins Blut sezerniert

· fehlgefaltete Proteine verbleiben im ER-Lumen

· Chaperone binden an diese Proteine, bis sie richtig gefaltet sind

· werden die Proteine nicht richtig gefaltet, werden sie im Proteasom abgebaut

· fehlgefaltete Proteine aktivieren UPR (unfolded protein response) → Protein- und Chaperonsynthese wird erhöht

· zuviele fehlgefahltete Proteine führen zu ER-Stress → Apoptose oder Krebs

1.  Proteine werden im ER und cis-Golgi mit Mannose-6-Phosphat bestückt

2.  im Trans-Golgi binden M6P-Rezeptoren an die M6P-Proteine

3.  vom Trans-Golgi wandern die M6P-Protein-Rezeptor-Komplexe zum Lysosom

4.  der tiefe pH im Lysosom führt zum dissoziieren des M6P-Rezeptors

5.  M6P-Rezeptor wird zurück zum Trans-Golgi transportiert

konstitutiv

  · Standardweg

  · Vesikel verschmelzen unkontrolliert mit der Zellmembran

     · in den Vesikeln enthaltenes Sekret wird sezerniert

     · in den Vesikeln enthaltene Membranproteine verbleiben in der Plasmamebran

regulativ

  · nur in spezialisierten sekretorischen Zellen

  · Sekret befindet sich in sekretorischen Vesikeln

  · sekretorische Vesikel sammeln sich in der Nähe der Plasmamembran

  · Fusion findet erst statt, wenn ein Signal (Hormon, Neurotransmitter, ...) von aussen eintrifft

· freie Diffusion / Transport (in nukleären Poren)

· Translokator-Proteine (in den Mitochondrien / Peroxisomen / im ER)

· Vesikel (im ER / Golgi / Lysosom / Plasmamembran)

1.  Cargo wird von Rezeptoren in der Plasmamembran gebunden

2.  Adaptin bindet an Rezeptoren

3.  Clathrin bindet an Adaptin

4.  Dynamin (GTPase) schnürt Vesikel von der Plasmamembran ab

5.  Adaptin-Clathrin-Komlex löst sich vom Vesikel

· die sieben Phosphoinositole in der Membran beeinflussen die Destination der endozytierten Vesikel

Herkunft → Mantel → Destination:

  · Golgi-Apparat             →  Clathrin + Adaptin 1    → Lysosom (via Endosom)

  · Plasmamembran      →  Clathrin + Adaptin 2    → Endosom

  · ER                                    →  COP II                                 → Golgi-Apparat

  · Golgi-Apparat             →  COP I                                  → ER

· Vesikel werden über Motorproteine auf Aktinfilamenten und Mikrotubuli transportiert

· SNARE-Komplex = VAMP (v-SNARE) + Syntaxin + SNAP-25 (t-SNARE)

1.  Rab-Protein (GTPase) auf Vesikel bindet an Rezeptor-Protein in der Membran

2.  v-SNARE des Vesikels verbindet sich mit dem t-SNARE der Membran (target membrane)

3.  Vesikel kann mit der Membran fusionieren (nur ~1.5nm Abstand bevor Fusion / benötigt Ca²⁺ für Fusion)

4.  NSF (ATPase / enthält Adaptorprotein α-SNAP) baut den SNARE-Komplex ab

Rab-Proteine sind spezifisch:

  · Rab 1 + 2:   ER → Golgi → ER

  · Rab 5:         Endosom

  · Rab 8:         Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) → Plasmamembran

  · Rab 6, 33:    Golgi → Golgi

1.  kontinuierliche Aufnahme von Molekülen

      · Pinocytose:     kleine Vesikel (< 150nm / machen alle Zellen)

      · Phagocytose:  grosse Vesikel (> 250nm / Phagosome für Bakterien)

     → Möglichkeit der Abgabe an andere Zelle (Transzytose)

Nur Endozytose:

2.  Aufnahme der Vesikel in das frühe Endosom (~ pH 6)

     → Möglichkeit der Abgabe an die Plasmamembran (recycling)

3.  Transport vom frühen Endosom in das späte Endosom (~ pH 5.4)

4.  Transport vom späten Endosom in das Lysosom (~ pH 5)

· Zelloberfläche verändert sich nicht, weil Endozytoserate = Exozytoserate

· Rezeptor-vermittelte Endozytose ermöglicht effiziente, gleichzeitige Aufnahme mehrerer Moleküle (z.B. LDL-Rezeptor)

· Aufnahme ganzer, lebender Zellen

· \(^{\space \mathrm{Auge}}_{0.2 \space mm} \space \xrightarrow{\mathrm{x} \space 1000} \space ^{\space \space \space \mathrm{LM}}_{200 \space nm} \space \xrightarrow{\mathrm{x} \space 1000} \space ^{\space \space \space \mathrm{EM}}_{0.2 \space nm} \)

· sichtbar im LM: Pflanzenzelle > Tierzelle > Bakterium

· sichtbar im EM: Virus > Ribosom > globuläres Protein > kleines Molekül (> Atom)

· Vergrösserung: um wieviel ein Bild vergrössert wurde

· Auflösung: Mass, wie gut kleinste Details eines Bildes unterschieden werden können

· Solange die Auflösung eines Bildes begrenzt ist, gibt eine Vergrösserung des Bildes keine neue Information

· Objekte, die kleiner sind als die halbe Wellenlänge des sichtbaren Lichts, sind nicht sichbar im LM

· praktisch ist die Auflösung auch durch die Linsenqualität limitiert

→ mit dem LM sind keine Objekte < 200nm sichtbar

· Objekte, die kleiner sind als die halbe Wellenlänge der Elektronen, sind nicht sichbar im EM

· Elektronen haben eine 1000x kleinere Wellenlänge als sichtbares Licht

→ mit dem EM sind keine Objekte < 0.2 nm sichtbar

· helle Lichtquelle, die mit einer Sammellinse auf die Probe gebündelt wird

· sehr dünne Probe, die lichtdurchlässig ist

· Optik um das Bild auf das Auge zu fokussieren

· Gewebe entnehmen → fixieren → dehydrieren → clearing → in Paraffin einschliessen → zerschneiden → einfärben

· Fixation: alle biochemischen Reaktionen stoppen / Probe vor Zerfall schützen / normalerweise mit Aldehyden

· Dehydratation: Alkoholbäder um Wasser zu entziehen

· Clearing: Xylolbad um Alkohol zu entfernen

· Einbettung in Paraffin: Härten des Gewebes / ermöglicht die Probe in dünne Scheibe zu zerschneiden

· Zerschneidung: mittels Microtom / 2 - 10 µm für LM / 40 - 100 nm für EM

· Einfärbung: Rehydratation in verdünnten Alkoholbädern / Zugeben von Färblösungen

· erste Antikörper binden an Mikrotubuli

· zweite Antikörper, die mit Fluoreszenzfarbstoff verbunden sind, können an erste Antikörper binden

· Filter vor der Probe lässt nur die Wellenlänge durch, die den Fluoreszenzfarbstoff anregt

· Filter vor dem Okular lässt nur die Wellenlänge durch, die vom Fluoreszenzfarbtoff emittiert wird

· eine Lochblende ermöglicht das Verschieben der Fokusebene

· im Bild ist der Vergleich vom LM zum EM zu sehen

· die Schnittdicke der Probe im EM beträgt 40 - 100nm ≈ 1000 Schnitte / Zelle

· Scanning Electron Microscope (SEM)

· Vorgehen: Probe mit Schwermetall beschichten → mit Kohlenstoff beschichten → mit Säure Probe wegätzen

· Probe wird eingefroren und danach gespalten

· es gibt mehrere mögliche Gefrierbrüche:

  · konvexer Bruch

  · konkaver Bruch

  · Querbruch

· Eine Zelle ist die strukturelle, funktionelle und biologische Grundeinheit aller bekannten lebenden Organismen

· automone Grundeinheit mit Selbstreplikationsmöglichkeit / es gibt Einzeller und mehrzellige Organismen

· sphärische, stabförmige oder spirale Form    /   viele verschiedene Formen

· klein (wenige µm lang)    /    grösser als Prokaryoten

· ein Kompartiment mit Cytoplasma und DNA    /    Cytoplasma mit Zellkern und Zellorganellen

· Zellwand um die Plasmamembran    /    weiter entwickelt als Prokaryoten

Zelle            ~    Haus

Bakterium    ~    Velo

Virus            ~    Maus

· besteht aus einer 5nm (6-10nm) dicken Lipiddoppelschicht (enthält Proteine)

· bildet Barriere zwischen Cytoplasma und Extrazellulärraum

· Prokaryoten besitzen im Gegensatz zu den Eukaryoten nur eine Plasmamembran (Zellmembran)

· Lipide werden immer von der Cytosol-Seite in die Membran eingefügt

    → Flippasen transferieren Lipide auf die andere Seite der Lipiddoppelschicht

· Transportproteine (Stofftransport zwischen Cytoplasma und ECR)

· Ankerproteine (mit Zytoskelett verbunden / wichtig für die Zellform)

· Rezeptorproteine (Bindung von extrazellulären Botenstoffen erzeugt intrazelluläres Signal)

· Enzyme (katalysieren Produktion von intrazellulären Molekülen aufgrund von spezifischen Signalen)

· fusselige Schicht auf der Aussenseite der Zelle

· besteht aus hydrophilen Polysacchariden, die an Lipide oder Proteine gebunden sind

· beteiligt an der Interzellulären Erkennung / Kommunikation / Zelladhäsion

· die Fluidität der Lipiddoppelschicht wird durch Alkohol erhöht

  → es werden Cholesterin-Moleküle eingebaut, damit die Fluidität konstant bleibt

  → damit die Membran weiterhin funktioniert und nicht steif wird, muss regelmässige Alkohol konsumiert werden