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Molekularbiologie fortgeschritten

Abkürzung für zellbiologische Agitatoren, zellbiologische Prozesse, Allgemeines zur Zellbiologie und Molekularbiologie

Abkürzung für zellbiologische Agitatoren, zellbiologische Prozesse, Allgemeines zur Zellbiologie und Molekularbiologie

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Michaela Boell
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Michaela Boell
Diese Karteikarten bieten einen vertieften Einblick in die Molekularbiologie auf Universitätsniveau, mit Fokus auf DNA- und RNA-Prozesse, Proteine und deren Regulation. Sie behandeln Themen wie RNA-Polymerasen, Proteinabbau, RNA-Editing, Kerntransport, DNA-Reparaturmechanismen und Chromosomenstruktur. Besonders relevant für Studierende der Biologie und Biochemie, die ihr Verständnis der molekularen Prozesse vertiefen möchten.
Karten
161
Lernende
2
Sprache
Deutsch
Kategorie
Biologie
Stufe
Universität
Erstellt / Aktualisiert
29.07.2013 / 14.12.2014
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Lernkarten

sHSP

  • IbpA/B
  • organisierte Aggregation
  • alpha-Crystallin Domän, n-terminaler Arm, c-terminaler Arm
  • ATP-unabhängig, 12-42kDA, Dimerisierung
  • Einlagerung in Proteinaggregate, Ermöglichung von Rückfaltung, Apoptoseblockierung, Aufhalten der Linsentrübung (Katarakt)

Hsp40

  • DnaJ: Co-chaperone für DnaK

trigger factor

  • Faltung verzögert bis N- und C-Terminus beieinander
  • PPIase (peptidylpolycistransisomerase)
  • hydrophobe Furche zur Bindung

SsrA Tag

  • bakteriell
  • problematische Polypeptidketten von zu kurzer Länge
  • wird durch tmRNA codiert, die an gestockte Ribosomen bindet und statts mRNA weitertranslatiert wird (mRNA -> RNAse R)
  • tmRNA im Komplex mit SmpB -> bindet A-Stelle
  • markiertes Protein wird dann durch ATP-abhängige ClpA/ClpB Proteasen  verdaut

Amyloide

  • Neurodegenerative Erkrankungen durch Proteinaggregation
    • Alzheimer: extrazelluläre Plaques, intrazelluläres Verheddern
    • Parkinson: Lewy bodies
    • TSE: Prionenplaque
    • spinozerebelläre Ataxie: polyglutaminbeinhaltende Proteine -> Einschlüsse in Cytoplasma und Kern
    • Tauopatie: Tauverknüpfung -> cytoplasmatisches Verheddern
    • familäre amyotrophische laterale Sclerose: bunina bodies
  • Amyloid: Aggregat, Fibrille, Plaque mit Cross-beta-sheet

chorea huntington

  • autosomal dominant
  • Erhöhunge der Anzahl des Basentripletts CAG im Huntingtingen -> Amyloidbildung
  • je mehr Glutamin desto früher die Symptome
  • -> Bewegungs- und psychische Störungen (C.elegans Mutanten)

Regulation der Degradation

posttranslationale Modifikationen

Konsequenzen posttranslationaler Modifikation

  • generell: Oberflächenveränderung
    • Verlust einer Interaktion
    • Gewinn einer Interaktion
    • Änderung der Konformation

Phosphorylierung

  • ΔG0I=32 kJ/mol
  • durch Kinasen, Klasse der Transferasen
  • Substrat:
    • Serin (86%), Threonin, Tyrosin
    • v.A. prokaryotisch: Histidin und Asparagin
  • Bsp: Proteinkinase A: durch CAMP allosterisch aktiviert, -> Phosphorylase aktiv -> G6P, Pseudosubstrat hemmt (Alanin statt Serin)
  • Bsp: RTK: durch Autophosphoryliering auf Signal hin aktiviert, Regulation von Differenzierung, Proliferation, Transformation
  • Konsequenzen:
    1. Aktivierung/Inaktivierung von Kinasen
    2. Rekrutierung von bspw E3 Ligasen (Phosphodegron)
    3. Transportsignal bspw durch Freilegung von NLS, Blockierung von NEs
    4. neue Interaktionsmöglichkeit

Dephosphorylierung

  • ΔG0I= -8 kJ/mol, keine Rückreaktion im eigentlichen Sinne
  • Hydrolyse -> ungeladene Seitenkette
  1. Phosphotyrosin Phosphatasen: meist Cystein im katalytischen Zentrum
  2. Phosphoserin/threonin Phosphatasen: Mg2+, Fe2+/Zn2+ oder Aspartat im katalytischen Zentrum
  3. Histidin Phosphatasen
  4. duale Phosphatasen

Domänen zur Erkennung von Phosphorylierung

  • SH2, PTB: Phosphotyrosin
  • 14-3-3, WW Domäne: Phosphoserin/threonin

Phosphorylierungsanalyse

  • Hinweis: Größenveränderung im SDS-Gel
  • in vivo Labeling mit P32 ATP -> IP/Autoradiogramm
  • in vitro Phosphorylierung mit entsprechender Kinase
  • Massenspektrometrie Proteinfragmente -> Lokalisation
  • Analyse:
    • phosphospezifische Antikörper,
    • phosphomimetische Mutanten (Glutamat, Apsartat, da negativ geladen)

Ubiquitinylierung/Modifizierung mit UBL

  • molekularer Schalter
  • gleiche Faltung, GG-Motiv am Cterminus
  • Verwandschaft:
    • SUMO: Regulation der Interaktionen
    • Nedd8: Regulation E3ligasen
    • und ISG15: Interferonantwort
    • Atg8: Autophagozygotie
    • Urm1: tRNA-Prozessierung
  • Verknüpfung an Lysinseitenketten der Zielproteine: ε-Aminogruppe Peptidbindung, außer Atg8: Aminogruppe des Ethanolamin
  • E1, E2, E3 + ATP -> Verknüfpung
  • Isopeptidasen (meist Cystein Proteasen) -> Spaltung

Sumoylierung

  • Säugerzellen: SUMO-1, -2, -3 -> Hunderte an Zielproteinen, Arabidopsis: 6 SUMO-Gene
  • Verknüpfung:
    • Antwort auf Zellzyklus, HS, DNAschäden
    • Maskierung, Interaktionsanküpfungspunkte, Konformationsänderungen
  • Spaltung: Isopeptidasen Ulp/Senp
  • Detektion:
    • SUMO = 10kDA, läuft bei 20 kDA
    • Achtung: SUMOpeptidasen extrem aktiv
    • E1, E2 und evtl. E3 für SUMOylierung gebraucht, ATPabhängige Verknüpfung
    • Lokalisierung über Massenspektrometrie und Mutagenese (Lysin -> Nicht-Lysin, Erkennungsmotiv -> weg)
    • in vivo gelabelt

Proteinhalbwertszeit

  • Minuten bis Tage
  • pulse chase Methode: radioaktives Labeling, Cycloheximid
  • d(Prot)/dt=ks-kd (Prot)

N-Degron

  • destabilisierendes Motiv
  • n-terminal: Arginin, Isoleucin, Leucin, Histidin, Lysin, Phenylalanin,Tryptophan, Tyrosin
  • internes Lysin
  • Erkennung durch E3-Ligase: Ubr1p
  • evtl. erst durch Modifikation Erkennung (Bsp. Phosphodegron)

Ubiquitin

  • UPS: Ubl- und Uba-Domänen erkennen K48 -> shuttling receptors -> 26S-Proteasom (oder direkt mit intrinsic receptors)
  • 76 AA, 8,5kDa
  • E3 Ligasen:
    • Ring finger: Adapter zwischen E2 und Zielprotein, wobei E2 Thioesterintermediat mit Ubiquitin ausbildet
    • Hect: Thioesterintermediat des E3 mit Ubiquitin
  • Meist Cysteinproteasen als Ubi-Isopeptidasen
  • sehr viele Ubiquitin erkennende Domänen, mit geringer Spezifität -> Kombinatorik macht spezifisch
  • unterschiedliche Ubiquitinketten haben unrschiedliche Topologie, Isopeptidketten unter Ubiquitinen:
    • C-Terminus
    • Met-1 -> linear
    • Lysin-11
    • Lysin-48 -> gedrängt -> Proteasom
    • Lysin-63 -> linaer

RING Cullin E3-Ligasen

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  • CRL1 und SCF (Kern: Skp1,Cul1, Rbx1; mit Fbox/Skp2)
  • Stabiler Kernbereich: cullin bzw. cul-like, Rbx1 bzw. RING, linker
  • austauschbare Substraterkennungsfaktoren: Adaptoren bspw Fbox
  • aktiviert durch Nedd8

HIF

  • Normoxie: direkte Hydroxylierung durch Prolylhydroxylasen ->  Erkennung durch VHL (von Hippel Lindau) E3 Ligase : Ubiqitylierung -> Abbau
  • Hypoxie: Anreicherung von HIF

Anaphase promoting complex

  • E3 Ligase
  • wird zu bestimmter Zeit aktiv

NFkappaB

  • Der Inhibitor IFkappaB wird nach Stress phosphoryliert, dann durch SCFFbw1 erkannt und ubiquityliert -> freies NFkappaB kann vom Cytoplasma in den Kern und als Transkriptionsfaktor aktiv werden

Aktivierung der E3 Ligase

  1. Anaphase Promoting Complex durch spindle check point Beschreiten
  2. SCFTIR1 durch Auxin

Fehlerhafte Degradation

  • Krebs (Fehlregulierung von Tumorsupressoren etc.)
  • neurodegenerative Krankheiten
  • Autoimmunkrankheiten
  • zystische Fibrose
  • velcade = Inhibitor der chymotrypsinlike activity -> gegen Krebs: Wachstum verzögert

Proteinabbau: Gründe

  1. Beseitigung von Fehlerhaftem
  2. Bedarf an AA
  3. Aktivierung/Reifung durch limitierte Proteolyse
  4. Änderung der Proteinmenge
  5. Antigenpräsentation

Antworten auf proteotoxischen Stress

  1. Hemmung des ER-Exports
  2. ERAD (ER-assoziierte Degradation)
  3. UPR (unfolded protein response)

-> Proteostasis

ER als Faltungsumgebung

  1. Signalpeptidspaltung
    • Translokation der naszierenden Kette
  2. Insertion von Transmembrandomänen
    • Signal innerhalb naszierender Kette
  3. Glycosylierung
    • OTC (Oligosaccharyltransferase Complex) -> erkennt NXS, NXT
    • -> N-acetylglucosamin-Mannose-Glucose-Bäumchen auf Asparaginrest der naszierenden Kette
  4. Verknüpfung mit GPI Anker
  5. Palmitylierung

Faltungsanalyse

  1. pulse chase Methode: Zeit
  2. Gelshift mittels nicht-reduzierender SDS-Page: Detektion von nicht nativen Disulfidbrücken
  3. konformationelle Antikörper
  4. Co-IP: Identifikation von Faltungsfaktoren, unterschiedliche Epitope ja nach Faltung

Erkennung ungefalteter Proteine

  1. ungepaarte Cysteine: PDI, Erp57
  2. hydrophobe Bereiche: BiP (Hsp70), PDI, UGGT
  3. Glykane: CNX, CRT, EDEM, OS9
  4. Erkennung spezifischer Eigenschaft: QCFaktoren

ERAD

  1. Abbau irreversibel fehlgefalteter Proteine
  2. Abbau überschüssiger Komplexuntereinheiten: Bsp: CD3 bringt negative Ladungen die positive Ladungen des TCR überdecken, welche eigentlich Degron darstellen
  3. Abbau beschädigter Proteine
  4. Regulation: Bsp: Cholesterin induziert Konformationsänderung in SSD der HMG-CoA-Reductase -> Rekrutierung von gp78 (ERAD Ubiqutin E3) über Adaptorprotein Insig
  5. Zusammenhang mit Krankheiten: zystische Fibrose, Typ-1 Diabetes Mellitus, Bakterien und Viren bedienen sich der ERAD Maschinerie: Bsp: SV40 wird durch BAP31 erkannt und über Bip u.A. in Vesikel geschnürt -> "Ausbruch"

drei ERAD Abbauwege

  1. C (Membranprotein mit cytosolischer Seite): Hsp70/Hsp90 -> Doa10
  2. M (Membranprotein): ? -> Hrd1 mit SEL1, OS9, EDEM
  3. L (luminales Protein, Membranpotein mit luminaler Seite): BiP, CRT/CNX -> Hrd1 mit SEL1, OS9, EDEM
    • n-verknüpftes Glykan vermittelt Interaktion mit CNX/CRT oder EDEM bei Glykoproteinen (Triage-Mechanismus, "Zuckerbäumchentrimmen" als Timer)
  • Hrd1= ERAD E3 Ligase für Ubiquitin
  • AAA+-ATPase p97/Cdc48 -> Proteine werden ins Cytosol gezogen
  • Hsp70/Hsp90 -> Substrate werden zum 26S Proteasom geleitet, dort wird Ubiquitin von Rpn11 abgespalten

Hrd1

  • RING domäne
  • ERAD Ubiquitin E3 Ligase

UPR

  • unfolded protein response
  • Faltungstress -> transkriptionelle Antwort = ER-Proteine, -> Änderung Zellhomoeostase, -differenzierung
  • Apoptose, wenn langzeitige UPR

drei parallele UPR Signaltransduktionswege

  1. XBP1
    • Peptidbindungstasche des IRE1 bindet ungefaltete Proteine, wird phosphoryliert, assoziiert mit vielen aktivierten Rezeptoren, IRE1: Spleißen von XBP1prämRNA (möglich durch translation pause site in der mRNA und entsprechende Bindestelle HR2 and der luminale ERmembran), dann Ligieren durch tRNA Ligase, statt XBP1u jetzt XBP1s -> TF
    • Transkription von Chaperonen und ERAD Faktoren
    • Abbau von mRNA am ER
  2. ATF6
    • erst Membranprotein, wird im ER zurückgehalten, ER-Stress -> Transport zum Golgi -> S1P und S2P (katalytisches Zink) setzt luminale und cytosolische Transkriptionsfaktordomäne frei
    • Transkription von ER Chaperonen
    • Biogenese von ER Membranen
  3. PERK
    • ungefaltete Proteine werden gebunden, PERK wird autophosphoryliert -> aktive Kinase: eIF2alpha wird phosphoryliert = Translationsinhbierung -> ATF4 wird häufiger translatiert (uORF)
    • antioxidativer Schutz durch Chaperone und Redoxhomeostase durch ATF4
    • Induktion von Apoptose durch CHOP (TF) durch ATF4

Lysosom

  • zelluläre Fraktionierung: Lysosomen und leichte Mitochondrien bei 15'000g
  • saurer pH: 1 ATP wird gespalten über die B und A UE -> 2H+ werden transloziert durch Drehung konservierter Glutaminreste der C-UE -> 4,5 - 5,0 (Auslgeich des Membranpotentials über K+-Import, Cl--Export)
  • Abbau
    • über 50 hydrolytische Enzyme, Model = Chymotrypsin (Serinprotease)
    • Glykokalix durch LAMP-1, -2 verhindert Abbau der Lysosomenmembran
    • V-ATPase -> pH: 4,5-5,0
    • heterogene Morphologie, Bleiphosphat-Färbung
  • Nährstoffgewinnung
  • Cholesterin-Homoeostase
  • Reparatur und Qualitätskontrolle der Plasmamembran
  • Immunabwehr: Phagozytose, Antigen-Präsentation von MHCII
  • Apoptose

Endozytose und Biosynthese -> lysosomaler Abbau

  • neusynthetisierte Proteine über TGN oder endosomalen Sortierweg zu Lysosom
    • M6P bereits in cis-Golgi angehängt durch GlcNac Phosphotransferase & UCE -> TGN (pH: 6,5-6,7): M6P-Rezeptor erkennt Fracht und bindet -> Endosom (pH: 6,0): Freisetzung der Fracht -> Transport in Lysosom
  • Plasmamembranproteine und Extrazelluläres via Endozytose zu EE und LE und schließlich Endolysosomen

pH des EE

pH des LE

pH des Lysosom

pH des Golgi

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