Molekularbiologie fortgeschritten

Beweis, dass semikonservativ:

• Dichteänderung nach erster Replikatin -> nicht konservativ (Elterndoppelstrang wird verändert)
• ab 2. Generation 2 distinkte Banden -> nicht polydispers (Elterndoppelstrang halb neu, Tochterdoppelstränge komplett neu)
• pro Generation Verdopplung der Menge an Tochterdoppelstrang -> semikonservativ

Genauigkeit:

1. Kopieren eines Musters
2. DNApolymerase: Kinetik, Korrekturlesen (-> durch 5'-3' Replikation ermöglicht)
   • höhere Affinität der korrekten Base, korrekte Paarung energetisch am besten
   • mechanische Katalyse durch Konformationsänderung
3. Fehlpaarungsreparatursystem
   • fehlendes Methylierungsmuster, Okazakifragmente, Ribonukleotide als Eigenschaften des neuen Strangs -> Fehlpaarung erkennbar (MMR)

• ATP-unabhängig
• ssDNA-Bruch -> freie Rotation -> Religation

• ATP-abhängig
• dsDNA-Bruch -> Supercoilentspannen -> Religation
• wichtig vor der Replikationsgabel

• genetisches Screening: zufällig ausgewähltes DNA Segment in Markerplasmid inseriert -> Ausplattierung: statistisch valide Zahl an Markerkolonien = Markerplasmid wurde repliziert
• BrdU -> Markierung von Replikation während S-Phase (-> nicht alle eukaryotischen Origins werden gleich häufig genutzt, Heterochromatin später repliziert)
• ChIP/chip: DNApräzipitation nach Fragmentierung, Hybridisierung auf Microarray -> Ort pro Zeitunterschied = Geschwindigkeit

• Giemsafärbung (Eosin, Azur) für ATreiche Bereiche der Metaphasenchromosomen, FISH: Farbe je nach Sequenz

1. Zentromer: Kinetochoransatzpunkt
2. Replikationsursprung (Origin): ATreich, mehrere Hundert bp lang
3. Telomer: TGreich, 3' ssDNA durch Primerentfernung am Verzögerungsstrang und Apollo-Nuclease-Aktivität am Leitstrang (5'-Ende zu kurz)
   • Telomerlänge: qFisH (Fluoreszenz ∼ Länge), southern Blot (Restriktion->Gel: Bandenlänge ∼ Länge), TelomerPCR
   • Telomerase: in Krebszellen, Eizellen aktiv, Dyskeratosis Congenita wenn mutiert
   • Shelterin -> Loopstruktur, Schutz, Regulation der Telomerase
   • Krebs durch:
     1. Bruch-Fusion
     2. ALT (reaktivierte Telomerase oder Rekombination) nach checkpoint-Versagen

• UV-induzierte CPD (cyclobutane pyrimidine dimers)
  • -> Replikationsstop -> Exonuklease
• Deaminierung
  • An mehrern Stellen möglich
  • U statt C paart besser mit A statt G
  • problematisch: 5'mC -> T
• Methylierung
• Oxidierung
• Depurinierung
  • meist A eingebaut an APStelle
• BER: Glycosylasen überprüfen mit flippingout, entfernen über Hydrolyse der N-glykosidischen Bindung -> AP-Stelle -> AP-Endonuklease schneidet Zucker, Phosphodiesterase schneidet Phosphatrückgrat -> DNA-Pol + Ligase
• NER: Multienzymkomplex (XBP, TFIIH, XPD, XPC...) scannt -> Konformationsänderung der Helix wird erkannt (Pyrimidindimer) -> schneidet Zuckerrückgrat beidseitig, Helicase entfernt Fragment -> DNA-Pol + Ligase
• NER und BER an Transkritption gekoppelt, Replikationsgabelstop =Rekrutierungssignal -> Transkriptionsstrang öfters repariert, wenn nicht: Transläsionssynthese (fehleranfällig)

• = eukaryotische DNA-Polymerase
• Transläsionssynthese
• ubiquitylierte PCNA rekrutiert TL-Pol

• NHEJ:
  • Nukleotidverlust (Exonukleaseaktivität an Überhängen -> blunt ends)
  • in menschlichen Zellen oft genutzt (2000 Narben pro Zelle mit Alter 70 Jahre)
  • G1-Phase: G1-CDK aktivieren nicht Exonukleaseaktivität (CtIP)
• HR:
  • fehlerfrei
  • immer mit Zurückschneiden eines Stranges (5'-Strang) -> Stranginvasion (3'-Strang) in homologen Doppelstrang, rapid zippering gewährleistet Effizienz des ansonsten zufälligen Prozesses, RecA (= Rad51) gewährleisten dreifach Strang Zusammenhalt und Homologie,
  • entweder Schwesterchromatid oder Schwesterdoppelstrang bei Replikation
  • resultiert in Genkonversion (Heterduplex) oder Crossover (Heteroduplex mit "neuer Nachbarschaft"), Vorraussetzng: zwei holiday junctions
  • MMR verhindert ungewollte Rekombination, nur während S-Phase zugelassen: S-CDK phosphoryliert CtlP= aktive Exonuklease, während Meiose durch Spo11 (-> dsBruch) und Mre11 (Nuclease) (und RecA) befördert

• ssDNA (>50nt) aktiviert checkpoints
• -> Zellzyklusarrest
• ATM/ATR = Sensoren erster Stelle, Kinasen
• Ataxia Telangiectasia:
  • autosomal rezessiv, Mutation in ATM
  • unkoordinierte Muskelbewegung, geistige Behinderung
  • 100 fache Steigerung allgemeines Krebsrisikos
  • sehr anfällig für ionisierende Strahlung

• Transkriptionsinteraktionsdomäne
• DNA-Bindedomäne
  1. Helix-Turn-Helix
     • Homeodomäne -> Homeobox
  2. zinc fingers
     • C₂H₂-Typ: 2 Cysteine, 2 Histidine binden an Zn²⁺, auch anders möglicj
     • binukleärer Typ: sechs Histidine, 6 Cysteine, 2 Zn²⁺
  3. basic-region leucine zipper

• protein 53kDa
• Tumorsupressor, TF
• interagiert mit TFIID (TF, TBP gehört dazu -> TFIIA-Bindung ermöglicht)
• verhindert Mitose
• DNA-Binderegion aus L2, L3, LSH (hier die meisten Mutationen -> Krebs)
• reagiert auf Stress -> p53 Degradation inhbiert über Phosphorylierung

1. kompetetive Hemmung des Promotors
2. Co-Rekrutierung von HDAC/Methylierung von HP1,K9, Rekrutierung anderer Korepressoren
3. stört Aktivatorinteraktion
4. Aktivator der p21 Expression

1. H3
   • H3.3 -> Transkriptionsaktivierung
   • CENP-A -> Centromerfunktion: erlaubt Mikrotubuliverankerung
2. H2A
   • H2A.X -> DNA-Reparatur, -Rekombination
   • H2A.Z -> Expression, Chromosomensegregation
   • macroH2A -> X-inaktivierung, Expressionshemmung

• RRM: RNA-Erkennungsmotiv
  • 0,5-1% aller Proteine
  • hnRNP, PABP...
  • 4 beta-Faltblätter -> Bindung 2-8nt, 2 alpha-Helices -> Stabilisierung
  • Phe, Tyr interkalieren mit Basen/Ribosen, Proteine

• NLS: rein, Lysin-Arginin (basisch)
• NES: raus, Leucin (hydrophob)
• Ran-Zyklus: GEF im Nucleus -> aus RanGPD wird RandGTP -> raus von allein: RanGAP im Cyotosol -> aus RanGTP wird RanGDP -> NTF2 der Kernpore ermöglicht Import von RanGDP
  • Import: RanGTP ermöglicht Cargosspaltung von Importin
  • Export: RanGTP ermöglicht Bindung und Export von Cargo mit Exportin

1. ADAR
   • -> v.A. prämRNA
   • dSRB-Domäne, Substrat=dsRNA
   • Deaminase-Domäne, Adenosin -> Inosin, unspezifisches Editing
   • Hauptsubstrat: Alu-Elemente: spezifisch für Primaten, Ursprung 7SL RNA, invers angeordnet -> ds
2. ADAT
   • -> tRNA
   • Substrat: Anticodonschleife in 8 tRNA bei höheren Eukaryonten
   • ermöglicht Wobble-bpaarung, I=C,=U
3. APOBEC/CDAR:
   • Cytosin DeAminase für RNA
   • Deaminase-Domäne: C->U (-> neues Stopcodon)
   • Substrat: ssRNA, spezifisch
   • RRM-Domäne -> Spezifität
4. Insertion und Deletion von Uracil (Mitochondrien, Kinetoplastida)

• ∼ 150nt lang
• Funktion: prämRNA-Prozessierung (U-RNA), Geleit von TF u.A.
• Untergruppe: snoRNA
• durch RNA Pol II, III

• Dynein, Kinesin entlang Mikrotubuli
• Myosin entlang Actin
• Cargo = Organellen, RNP

• Dcp2 + Aktivatoren
• Deadenylasen
• kein Exosom!
• Xrn1
• -> zytoplasmatischer RNA-Abbau: besonders nonsense, AU-reiche Elemente, microRNA-Bindestellen

• 26S-Proteasom
  • Regulatorkomplex mit Basis und Deckel, ATPabhängiges Substrat entfalten/ Ubiquitin abspalten
  • 20S Proteasedomäne
• ClpAP
  • ATPase, entfaltet Substrat ATPabhängig
  • Protease
• HsIU/HsIV Protease
  • AAA-ATPase (HsIU)
  • Peptidase (HsIV)

• prokaryotisch: nur eine
• eukaryotisch:
  1. Pol I : 18S, 5,8S, 28S rRNA
  2. Pol II: mRNA, longncRNA, snRNA (snoRNA), siRNA, miRNA
  3. Pol III: 5S rRNA, snRNA, sRNA

• =Histonchaperon
• belädt Nucleosomen mit H2A-H2B Dimeren

• =Histonchaperon
• belädt Nucleosomen mit H3-H4 Tetrameren

3,5%

• durchschnittliche LINE-Länge: 6 bis 8 • 10³bp
• Long INterspersed Elements
• häufig im eukaryotischen Genom
• RNA pol II Promotor innerhalb LINE -> RNA, außerdem reverse Transkriptase, oftmals auch Endonuklease (bspw. RNAse H)
• "The reverse transcriptase has a higher specificity for the LINE RNA than other RNA, and makes a DNA copy of the RNA that can be integrated into the genome at a new site."

• durschnittliche SINE-Länge: 100-400 bp
• Short INterspersed Elements repräsentieren revers-transkribierte RNA Moleküle
• Retrotransposon ohne eigene reverse Transkriptase
• die meisten = Alu-Elemente

• = proliferating cell nuclear antigen
• eukaryotische sliding clamp
• N-Terminus und C-Terminus topologisch identisch -> drei Stück = Ringstruktur

• =Primase der Replikation
• -> RNA Primer

• = eukaryotische DNA-Polymerase
• -> Verzögerungsstrangsynthese

• = eukaryotische DNA-Polymerase
• -> Leitstrangsynthese

• = Exonuklease
• entfernt RNA Primer zwischen Okazakifragmenten

• = eukaryotische Helicase
• spaltet Doppelstrang mechanisch, ATP-abhängig
• wandert auf Leitstrang 3'-5'
  • prokaryotische wandert auf Verzögerungsstrang 5'-3'
  • Test nach Laufrichtung: Einzelstrang mit zwei unterschiedlich langen Einzelstrang Stücken an den Enden -> Auftrennung nach Größe

• Cdc6, Cdt1 und MCM2-7 binden an ORC (origin recognition complex) -> Cdt wird phosphoryliert und degradiert, Cdc ebenfalls weg -> ORC +MCM2-7 = Pre-RC
• assembliert in G1
• ORC bleibt immer gebunden, Cdc6 und Cdt1 werden durch Cdk regulierte Phosphorylierung abgebaut bzw. inhibiert + Phosphorylierung von ORC = Regulation des Zellzyklus

• = Pre-Rc + GINS + Cdc45
• -> GINS und Cdc45 ermöglichen Bindung von ssDNA durch MCM2-7
• binden der ssDNA stimuliert ATPase-Aktivität von MCM2-7

= eukaryotisches SSBP

Erkennung von Fehlpaarung -> Stück des neuen Strangs wird ausgeschnitten