Methoden der DNA-Analyse

Viren, die Bakterien infizieren

Nukleinsäure-Moleküle enthält Gene für Phagen-Replikation + schützende, umgebende Proteinhülle = Capsid

Infektion = injizieren der DNA in die Wirtszelle, Phage bliebt draußen

DNA repliziert, Proteine exprimiert, Phage zusammen gebaut & freigegeben

Kopf- Schwanz-Phage

großes lineares Genom

"Stuffer" = Zentralregion des Genoms, kann manipuliert werden

zwei Lebens-Zyklen

• Lytic: replikativ = Phagen werden hergestellt und Zelle lysiert
• lysogen: latent = DNA ins GEnom einegebaut --> an Tochterzellen weitergegeben

• Insertionsvektor
  • darf Genomgröße max. um 5% erhöhen
• Ersatz-Vektor
  • Ersatz des Stuffers mit target DNA (8-24kb, eukaryotische Gene)

filamentöser Phage

einzelsträngiges, zirkuläres Genom (6,4kb)

kann Fragmente bis zur 6x Größe des eigenen Genoms aufnehmen, aber je größer desto instabiler

• Sequenzierungen
• site-directed mutagenesis
• jede Technik ssDNA erfordert

Plasmid mit colE1 ori & M13 ori.

um ssDNA zu erhalten wird transfomierter Stamm mit Helefr Phagen (M13KO7) infiziert

--> kann einzelsträngige Kopien des Phagemids herstellen --> verpackt -- entlassen --> isoliert.

• längere DNA Fragmente
• Genklonierungen
• viele Klnoe für aufbau von Bibliotheken

• in-vivo Promotor
• RBS
• evt. Terminator

für Proteien die in Zellen nur selten vorkommen, oder schwer zu isolieren sind

• Herstellung von großen Mengen eines Proteins
• Studien über Struktur und Funktion eines Proteins

LacI: kein Teil des Oeprons, produziert den Lac-Repressor,d er an Lac-Operator bindet und somit das Lac-Operon inhibiert

Lac-Operon:

• lacZ: beta-Galactosidase
• lacY: Permease
• lacA: Transacetylase

Bei Anwesenheit von Lactose bindet Allolactose (Abbauprodukt) an Repressor --> dieser kann nicht mehr an Operaot bindet --> Gene werden exrpimiert --> Lactose abgebaut

Wirtsstamm kodiert für C-Terminus der beta-Galactosidase (omega Fragment)

Plasmid kodiert für N-Terminus (= alpha-Fragment)

Nur wenn beide Teile vorhanden sind, ist funktionsfähige beta-Galactosidase vorhanden.

wenn X-Gal zugegeben wird, kann Galactosidase dieses spalten --> blauer Farbstoff

LAc-Z auf dem Plasmid  enthält die MCS. Wenn ein Gen hinein-kloniert wird, wird LacZ zerstört --> nicht exprimiert --> keine beta-Galactosidase --> keine SPaltung von X-Gal = weiße Kolonie

Wenn nicht hineinklniert wurde --> Enzym-->Spaltung = Blaue Kolonie

• T7-RNA-Pol.-Promotor
  mt lac-Represor, durch IPTG induziert
• Lambda-PL-Promtor, LAmbda-Repressor, durch trp Repressor kontrolliert
• pBAD, über araC und Arabinose gesteuert

Ein System um Proteine in großen Mengen zu exprimieren

besteht aus:

• pET Plasmid
  • target Gene hinter einem T7P-Promotor mit lac-Operator
  • lacI
• E.coli-Stamm (genetisch verändert)
  • T7-RNA.Pol-GEn hinter lac-Operon
  • lacI (mit Promotor der immer aktiv ist)

LacI im genom stellt lac-repressor her, der lac-Operator im Genom bindet --> keien Expression von T7-RNA. Pol --> keine Expression von target genen

lacI im Plasmide --> auch repressor hergestellt --> inaktiver T7-Promotor

IPTG hinzugegeben

• bindet lac-repressor
• lac-promotor aktiviert
• E.coli RNA-Pol bindet und T7-RNA-Pol. wird exprimiert
• IPTG bindet auch Repressor von Plasmiden
• T7-Promotor aktiv
• T7-Pol. bindet
• target gene exprimiert

Zur Expression in Säugerzellen.

Enthält:

• 3'-T Überhänge an Insertionsstelle (durch EcoRV geschnitten) zur besseren Ligation mit dem Isnert
• alpha-Peptid der beta-Galactosidase (blau-weiß-screening)
• Cytomegalovirus immediate-early enhance/promotor region (konstituive Expressiond er Proteine)
• Neomycin-Gen für Selektion

• Cosmide
• Bacteriophage P1 Plasmid
• BACs
• YACs

verbessertes mabda-plasmid

• 5kb
• Antibiotikaresistenz
• ori lambda cos-stellen (cohesive Enden --> erleichtern zirkularisierung)
• 37-52kb Inserts

= Bacterial artifical chromosome = Plasmide mit größerem Fassungsvermögen

basiert auf F-Plasmide (100kb, 1-2 Kopien pri Zelle), braucht nur wenige Gene zur Replikation

kann bis zu 300kb DNa aufnehmen, leicht zu manipulieren, leicht zu transformieren

= Yeast artificial chromosome

wie BACs aber synthetisch hergstellt (kein natürlicher Ursprung)

enthalten:

• Zentromer
• Telomer
• Marker-Gene
• RE-Schnittstellen
• ori

Inserts (100-1000kb) zwischen Zentromer und Telomer kloniert

• Organismus
• Plasmif
• Generiung mittels PCR
• Chemische Synthese
• Kauf

• Gen-Ort und die Umgebung
• Restriktionsschnittstellen

von genomischer DNA

Die Plasmidkarte (Nukleinsäuresequenz)

Restriktionsschnittstellen

von Plasmid-DNA

• Nukleinsäure-Sequenz von Gen & Umgebung
• Primerbindungsstellen

Von genomischer & Plasmid-DNA möglich

Die Nukleinsäureseuenz

• Isolierung von Genen
• Analyse der Gensequenz
• Vervielfachung eines Gens
• Expression eines Gens
• Gendisruption
• Mutationsanalyse
• etc.

• Typ I
  • schneidet weit von Erkennungsstelle entfernt
  • braucht ATP
     
• Typ II
  • Schnittstelle liegt in der Erkennungsstelle (Palindrom)
  • verbraucht kein ATP
  • machen sticky oder blunt ends
• Typ III
  • schneidet 24-26 bp stromabwärts der Erkennungssequenz
  • braucht ATP

haben selbe Erkennungs-Sequenz und schneiden an der selben Sequenz.

erstes gefundenes ist der Prototyp, nachfolgende sind die Isoschizomere.

meist aus verschiedenen Bakterienstämmen isoliert ---> können unterschiedliche Reaktionsbedingungen brauchen

Erkennen die selbe Sequenz aber schneiden unterschiedlich

Erkennt eine etwas andere Sequenz aber erzeugt die selben Enden

Entstandene Enden können zusammen ligiert werden, aber möglicherweise nicht mehr durch diese Enzyme geschnitten werden.

• Virulenz-Plasmide
• Konjugatiosnplasmide
  Übertragung genetischen Materials über Sex-pilus
• Drug-Restistence-Plasmide
  Antibiotika-Resistenzen

• Klonierungsvektoren
• Shuttle-Vektoren
• Expressionsvektoren

können prokaryotisch, eukaryotisch oder viral sein

Vektoren die teils Sequenzen von Bakterien und Bakteriophagen beinhalten

ein Plasmid, das modifiziert wurde um neue Gene aufzunehmen. Dient zum "Transport" von Sequenzen zwischen biologischen hosts und dem teströhrchen.

• ori
• selektionsmarker
• MCS (Ort wo Fremd-DAN inseriert wird, ohne Replikation oder Selektion zu stören)

• geringe Größe
  • leicht zu manipulieren
  • leicht zu isolieren
• leicht auf Zellen übertragbar
• Methoden für Selektion

= Chimären-Plasmid

mit eingebrachter Fremd-DNA in der MCS

Wirts-Bereich

• Spezies-Spezifisch
• broad-hoast (replizieren in vielen Bakterien)
• shuttle-vector: verschiedene ori's auf demselben Vektor, für die Replikation in verschiedenen Spezies

Replikationsrichtung

• unidirektional
• bidirektional

Replikationsursprung

• low-copy: gleich wie genomische DNA
• high-copy
• eig sollte eine hohe kopienzahl sein, aber zu hohe Zahl kann toxisch für Wirt sein

Inkompatibilität: verschiedene Arten von Plasmide mit gleichem ori können nicht in der gleichen Zelle überleben

Resistenz lässt es zu, dass Zelle auf Antibiotika-haltigem Medium wächst.

Resistenz befindet sich auf dem Plasmid --> nur Zellen die Plasmid haben, überleben

= Transformations-Effizienz

Arten von Resistenzen

• Modifikation am Ribosom
• Blockieren von Membrantransport-Systemen
• Inaktivierung des Antibiotikums