Methoden der DNA-Analyse
Klonierung, Plasmide, Restriktions-Endonukleasen, Protein-Extraktion
Klonierung, Plasmide, Restriktions-Endonukleasen, Protein-Extraktion
Was sind Bakteriophagen?
Viren, die Bakterien infizieren
Nukleinsäure-Moleküle enthält Gene für Phagen-Replikation + schützende, umgebende Proteinhülle = Capsid
Infektion = injizieren der DNA in die Wirtszelle, Phage bliebt draußen
DNA repliziert, Proteine exprimiert, Phage zusammen gebaut & freigegeben
Was ist der Bakteriophage Lambda?
Kopf- Schwanz-Phage
großes lineares Genom
"Stuffer" = Zentralregion des Genoms, kann manipuliert werden
zwei Lebens-Zyklen
- Lytic: replikativ = Phagen werden hergestellt und Zelle lysiert
- lysogen: latent = DNA ins GEnom einegebaut --> an Tochterzellen weitergegeben
Wie können Lambda-Phagen für Klonierung verwendet werden?
- Insertionsvektor
- darf Genomgröße max. um 5% erhöhen
- Ersatz-Vektor
- Ersatz des Stuffers mit target DNA (8-24kb, eukaryotische Gene)
Was ist M13?
filamentöser Phage
einzelsträngiges, zirkuläres Genom (6,4kb)
kann Fragmente bis zur 6x Größe des eigenen Genoms aufnehmen, aber je größer desto instabiler
Wofür wird M13 verwendet?
- Sequenzierungen
- site-directed mutagenesis
- jede Technik ssDNA erfordert
Was sind Phagemide?
Plasmid mit colE1 ori & M13 ori.
um ssDNA zu erhalten wird transfomierter Stamm mit Helefr Phagen (M13KO7) infiziert
--> kann einzelsträngige Kopien des Phagemids herstellen --> verpackt -- entlassen --> isoliert.
Wofür wird Lambda verwendet?
- längere DNA Fragmente
- Genklonierungen
- viele Klnoe für aufbau von Bibliotheken
Welche zusätzlichem Elemente enthält ein Expressionsvektor?
- in-vivo Promotor
- RBS
- evt. Terminator
Wozu dienen Expressionsvektoren?
für Proteien die in Zellen nur selten vorkommen, oder schwer zu isolieren sind
- Herstellung von großen Mengen eines Proteins
- Studien über Struktur und Funktion eines Proteins
Wie funktioniert das Lac-Operon?
LacI: kein Teil des Oeprons, produziert den Lac-Repressor,d er an Lac-Operator bindet und somit das Lac-Operon inhibiert
Lac-Operon:
- lacZ: beta-Galactosidase
- lacY: Permease
- lacA: Transacetylase
Bei Anwesenheit von Lactose bindet Allolactose (Abbauprodukt) an Repressor --> dieser kann nicht mehr an Operaot bindet --> Gene werden exrpimiert --> Lactose abgebaut
Wie funktioniert die alpha-Komplementation?
Wirtsstamm kodiert für C-Terminus der beta-Galactosidase (omega Fragment)
Plasmid kodiert für N-Terminus (= alpha-Fragment)
Nur wenn beide Teile vorhanden sind, ist funktionsfähige beta-Galactosidase vorhanden.
wenn X-Gal zugegeben wird, kann Galactosidase dieses spalten --> blauer Farbstoff
Wie funktioniert das blau-weiß screening?
LAc-Z auf dem Plasmid enthält die MCS. Wenn ein Gen hinein-kloniert wird, wird LacZ zerstört --> nicht exprimiert --> keine beta-Galactosidase --> keine SPaltung von X-Gal = weiße Kolonie
Wenn nicht hineinklniert wurde --> Enzym-->Spaltung = Blaue Kolonie
Welche Kontrollsysteme der Genexpression gibt es?
- T7-RNA-Pol.-Promotor
mt lac-Represor, durch IPTG induziert - Lambda-PL-Promtor, LAmbda-Repressor, durch trp Repressor kontrolliert
- pBAD, über araC und Arabinose gesteuert
Was ist das pET-System?
Ein System um Proteine in großen Mengen zu exprimieren
besteht aus:
- pET Plasmid
- target Gene hinter einem T7P-Promotor mit lac-Operator
- lacI
- E.coli-Stamm (genetisch verändert)
- T7-RNA.Pol-GEn hinter lac-Operon
- lacI (mit Promotor der immer aktiv ist)
Wie funktioniert dei Expression mit dem pET-System?
LacI im genom stellt lac-repressor her, der lac-Operator im Genom bindet --> keien Expression von T7-RNA. Pol --> keine Expression von target genen
lacI im Plasmide --> auch repressor hergestellt --> inaktiver T7-Promotor
IPTG hinzugegeben
- bindet lac-repressor
- lac-promotor aktiviert
- E.coli RNA-Pol bindet und T7-RNA-Pol. wird exprimiert
- IPTG bindet auch Repressor von Plasmiden
- T7-Promotor aktiv
- T7-Pol. bindet
- target gene exprimiert
Was ist der pTargeT Vektor?
Zur Expression in Säugerzellen.
Enthält:
- 3'-T Überhänge an Insertionsstelle (durch EcoRV geschnitten) zur besseren Ligation mit dem Isnert
- alpha-Peptid der beta-Galactosidase (blau-weiß-screening)
- Cytomegalovirus immediate-early enhance/promotor region (konstituive Expressiond er Proteine)
- Neomycin-Gen für Selektion
Welche Möglichkeiten gibt es große DNA Fragmente zu klonieren?
- Cosmide
- Bacteriophage P1 Plasmid
- BACs
- YACs
Was sind COSMIDE?
verbessertes mabda-plasmid
- 5kb
- Antibiotikaresistenz
- ori lambda cos-stellen (cohesive Enden --> erleichtern zirkularisierung)
- 37-52kb Inserts
Was sind BACs?
= Bacterial artifical chromosome = Plasmide mit größerem Fassungsvermögen
basiert auf F-Plasmide (100kb, 1-2 Kopien pri Zelle), braucht nur wenige Gene zur Replikation
kann bis zu 300kb DNa aufnehmen, leicht zu manipulieren, leicht zu transformieren
Was sind YACs?
= Yeast artificial chromosome
wie BACs aber synthetisch hergstellt (kein natürlicher Ursprung)
enthalten:
- Zentromer
- Telomer
- Marker-Gene
- RE-Schnittstellen
- ori
Inserts (100-1000kb) zwischen Zentromer und Telomer kloniert
Welche Schritte gehören zu einer Klonierung?
- Gen-Isolierung
- Vektor.Isolierung
- Vektor-, Gen-Restriktion
- Ligation vom Gen in den Vektor
- Kompetent machend er Zellen
- Transformation
- Selektion & Screening
- Verifizierung
Woher bekommt man das zu isolierende Gen?
- Organismus
- Plasmif
- Generiung mittels PCR
- Chemische Synthese
- Kauf
Was muss man wissen um ein Gen aus einem Organismus zu isolieren?
- Gen-Ort und die Umgebung
- Restriktionsschnittstellen
von genomischer DNA
Was muss man wissen um ein Gen von einem Plasmid zu isolieren?
Die Plasmidkarte (Nukleinsäuresequenz)
Restriktionsschnittstellen
von Plasmid-DNA
Was muss man wissen um ein Gen mittels PCR zu Generieren?
- Nukleinsäure-Sequenz von Gen & Umgebung
- Primerbindungsstellen
Von genomischer & Plasmid-DNA möglich
Was muss man wissen um ein Gen mittels chemischer Syntehse zu generieren?
Die Nukleinsäureseuenz
Wozu kloniert man Gene?
- Isolierung von Genen
- Analyse der Gensequenz
- Vervielfachung eines Gens
- Expression eines Gens
- Gendisruption
- Mutationsanalyse
- etc.
Welche Arten von Restriktions-Endonukleasen gibt es?
- Typ I
- schneidet weit von Erkennungsstelle entfernt
- braucht ATP
- Typ II
- Schnittstelle liegt in der Erkennungsstelle (Palindrom)
- verbraucht kein ATP
- machen sticky oder blunt ends
- Typ III
- schneidet 24-26 bp stromabwärts der Erkennungssequenz
- braucht ATP
Was sind Isoschizomere?
haben selbe Erkennungs-Sequenz und schneiden an der selben Sequenz.
erstes gefundenes ist der Prototyp, nachfolgende sind die Isoschizomere.
meist aus verschiedenen Bakterienstämmen isoliert ---> können unterschiedliche Reaktionsbedingungen brauchen
Was sind Neoschizomere?
Erkennen die selbe Sequenz aber schneiden unterschiedlich
Was sind Isocaudamere?
Erkennt eine etwas andere Sequenz aber erzeugt die selben Enden
Entstandene Enden können zusammen ligiert werden, aber möglicherweise nicht mehr durch diese Enzyme geschnitten werden.
Welche Arten von natürlich-vorkommenden Plasmiden gibt es?
- Virulenz-Plasmide
- Konjugatiosnplasmide
Übertragung genetischen Materials über Sex-pilus - Drug-Restistence-Plasmide
Antibiotika-Resistenzen
Welche Arten von Vektoren gibt es?
- Klonierungsvektoren
- Shuttle-Vektoren
- Expressionsvektoren
können prokaryotisch, eukaryotisch oder viral sein
Was sind Phagemide?
Vektoren die teils Sequenzen von Bakterien und Bakteriophagen beinhalten
Was ist ein Klonierungsvektor?
ein Plasmid, das modifiziert wurde um neue Gene aufzunehmen. Dient zum "Transport" von Sequenzen zwischen biologischen hosts und dem teströhrchen.
Welche essentiellen Bestandteile benötigt ein Klonierungsvektor?
- ori
- selektionsmarker
- MCS (Ort wo Fremd-DAN inseriert wird, ohne Replikation oder Selektion zu stören)
Welche Eigenschaften braucht ein Klonierungsvektor?
- geringe Größe
- leicht zu manipulieren
- leicht zu isolieren
- leicht auf Zellen übertragbar
- Methoden für Selektion
Was sind Rekombinante Plasmide?
= Chimären-Plasmid
mit eingebrachter Fremd-DNA in der MCS
Welche Eigenschaften charakterisieren den ORI?
Wirts-Bereich
- Spezies-Spezifisch
- broad-hoast (replizieren in vielen Bakterien)
- shuttle-vector: verschiedene ori's auf demselben Vektor, für die Replikation in verschiedenen Spezies
Replikationsrichtung
- unidirektional
- bidirektional
Replikationsursprung
- low-copy: gleich wie genomische DNA
- high-copy
- eig sollte eine hohe kopienzahl sein, aber zu hohe Zahl kann toxisch für Wirt sein
Inkompatibilität: verschiedene Arten von Plasmide mit gleichem ori können nicht in der gleichen Zelle überleben
Wie funktioniert die Selektion mittels Antibiotika-Resistenzen?
Resistenz lässt es zu, dass Zelle auf Antibiotika-haltigem Medium wächst.
Resistenz befindet sich auf dem Plasmid --> nur Zellen die Plasmid haben, überleben
= Transformations-Effizienz
Arten von Resistenzen
- Modifikation am Ribosom
- Blockieren von Membrantransport-Systemen
- Inaktivierung des Antibiotikums
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Lernkarten
Welche Schritte gehören zu einer Klonierung?
- Gen-Isolierung
- Vektor.Isolierung
- Vektor-, Gen-Restriktion
- Ligation vom Gen in den Vektor
- Kompetent machend er Zellen
- Transformation
- Selektion & Screening
- Verifizierung
Woher bekommt man das zu isolierende Gen?
- Organismus
- Plasmif
- Generiung mittels PCR
- Chemische Synthese
- Kauf
Was muss man wissen um ein Gen aus einem Organismus zu isolieren?
- Gen-Ort und die Umgebung
- Restriktionsschnittstellen
von genomischer DNA
Was muss man wissen um ein Gen von einem Plasmid zu isolieren?
Die Plasmidkarte (Nukleinsäuresequenz)
Restriktionsschnittstellen
von Plasmid-DNA
Was muss man wissen um ein Gen mittels PCR zu Generieren?
- Nukleinsäure-Sequenz von Gen & Umgebung
- Primerbindungsstellen
Von genomischer & Plasmid-DNA möglich
Was muss man wissen um ein Gen mittels chemischer Syntehse zu generieren?
Die Nukleinsäureseuenz
Wozu kloniert man Gene?
- Isolierung von Genen
- Analyse der Gensequenz
- Vervielfachung eines Gens
- Expression eines Gens
- Gendisruption
- Mutationsanalyse
- etc.
Welche Arten von Restriktions-Endonukleasen gibt es?
- Typ I
- schneidet weit von Erkennungsstelle entfernt
- braucht ATP
- Typ II
- Schnittstelle liegt in der Erkennungsstelle (Palindrom)
- verbraucht kein ATP
- machen sticky oder blunt ends
- Typ III
- schneidet 24-26 bp stromabwärts der Erkennungssequenz
- braucht ATP
Was sind Isoschizomere?
haben selbe Erkennungs-Sequenz und schneiden an der selben Sequenz.
erstes gefundenes ist der Prototyp, nachfolgende sind die Isoschizomere.
meist aus verschiedenen Bakterienstämmen isoliert ---> können unterschiedliche Reaktionsbedingungen brauchen
Was sind Neoschizomere?
Erkennen die selbe Sequenz aber schneiden unterschiedlich
Was sind Isocaudamere?
Erkennt eine etwas andere Sequenz aber erzeugt die selben Enden
Entstandene Enden können zusammen ligiert werden, aber möglicherweise nicht mehr durch diese Enzyme geschnitten werden.
Welche Arten von natürlich-vorkommenden Plasmiden gibt es?
- Virulenz-Plasmide
- Konjugatiosnplasmide
Übertragung genetischen Materials über Sex-pilus - Drug-Restistence-Plasmide
Antibiotika-Resistenzen
Welche Arten von Vektoren gibt es?
- Klonierungsvektoren
- Shuttle-Vektoren
- Expressionsvektoren
können prokaryotisch, eukaryotisch oder viral sein
Was sind Phagemide?
Vektoren die teils Sequenzen von Bakterien und Bakteriophagen beinhalten
Was ist ein Klonierungsvektor?
ein Plasmid, das modifiziert wurde um neue Gene aufzunehmen. Dient zum "Transport" von Sequenzen zwischen biologischen hosts und dem teströhrchen.
Welche essentiellen Bestandteile benötigt ein Klonierungsvektor?
- ori
- selektionsmarker
- MCS (Ort wo Fremd-DAN inseriert wird, ohne Replikation oder Selektion zu stören)
Welche Eigenschaften braucht ein Klonierungsvektor?
- geringe Größe
- leicht zu manipulieren
- leicht zu isolieren
- leicht auf Zellen übertragbar
- Methoden für Selektion
Was sind Rekombinante Plasmide?
= Chimären-Plasmid
mit eingebrachter Fremd-DNA in der MCS
Welche Eigenschaften charakterisieren den ORI?
Wirts-Bereich
- Spezies-Spezifisch
- broad-hoast (replizieren in vielen Bakterien)
- shuttle-vector: verschiedene ori's auf demselben Vektor, für die Replikation in verschiedenen Spezies
Replikationsrichtung
- unidirektional
- bidirektional
Replikationsursprung
- low-copy: gleich wie genomische DNA
- high-copy
- eig sollte eine hohe kopienzahl sein, aber zu hohe Zahl kann toxisch für Wirt sein
Inkompatibilität: verschiedene Arten von Plasmide mit gleichem ori können nicht in der gleichen Zelle überleben
Wie funktioniert die Selektion mittels Antibiotika-Resistenzen?
Resistenz lässt es zu, dass Zelle auf Antibiotika-haltigem Medium wächst.
Resistenz befindet sich auf dem Plasmid --> nur Zellen die Plasmid haben, überleben
= Transformations-Effizienz
Arten von Resistenzen
- Modifikation am Ribosom
- Blockieren von Membrantransport-Systemen
- Inaktivierung des Antibiotikums
Was ist pUC18/19?
künstlich hergestellte bakterielle Plasmide, Derivat des pBR322
- 2686bp (klein)
- high-copy Plasmide
- lac-Operon zur Kontrolle der Transkription
- Ampicillin-Resistenz
Unterschied: inverse Orientierung der MCS, Name pUC (plasmid, University of California)
Was ist direktionelles Klonieren?
gewährleistet, dass das Insert eine bestimmte Orientierung hat
Insert & Vektor werden mit 2 RE geschnitten, Vektor und Insert haben jeweils 2 unterschiedliche Enden
Wozu werden linker bei der Klonierung verwendet?
Um Restriktionsschnittstellen an die Enden des inserts zu bekommen. Schnittstelle darf im Insert nicht vorkommen.
welche Eigenschaften hat ein idealer Puffer?
- pKA zwischen 6-8
- chemisch inert
- polar
- nicht toxisch
- salz- und temperatur-relevant
- preiswert
Welche Reaktionspuffer gibt es?
- TRIS
- HEPES
- BES
- MOPS
- MES
Welche Bestendteile enthält der Reaktionspuffer?
- Salz
stabilisiert Protein-Struktur, erleichter Protein-DNA Wechselwirkung - Zweiwertige Metallionen
für Enzymaktivität - Glycerin
stabilisiert Proteinstruktur bei Lagerung - EDTA
Chelat, entfernt zweiwrtige Kationen, vor allem bei der Lagerung, als schutz vor Metall-Ionen abhämgiger Protease - Beta-Mercaptoethanol, Dithitreithol
Reduktionsmittel, verhindert unerwünschte Disulfid-Bindungen - nicht-spezifische Proteine (BSA)
- Ander Co-Faktoren: (ATP, NADH)
Welche DNA-Polymerasen werden verwendet?
E.coli DNA Polymerase I
- mäßig prozessiv
- 3'-5'-proof reading
- 5'-3' strang verdrängende Exonuklease
- zur Markeirung von DNA mittels nick-translation
Klenow-Fragment
- c-terminale 70% der E.coli DNA Polymerase I
- fehl 5'-3' Exonuklease Aktivität
- Markierung von DNA durch auffüllen von kohäsiven Enden
- Erzeugung stumpfer Enden (durch 5'-3' Polymerase, oder 3'5' Exonuklease)
- früher proteolytisch erzeugt, heute kloniert
Was ist die Reverse Transkriptase?
RNA-abhängige DNA-Polymerase, wird verwendet um cDNA Kopien von RNA zu machen.
- Quantifizierung von RNA
- Klonierung von intron-losen Gene
welche reversen Transkriptasen werden verwendet?
- M-MLV - Moloney murien leukemia virus
- AMV avian myeloblastosis virus
Was machen DNA Ligasen?
schließen EInzelstrangbrüche.
- Okazaki-Fragmente
- DNAa-Reparatur
zwei Klassen
- Klasse I: NAD+ als Cofaktor (Bakterien)
- Klasse II: ATP ---"---- (Eukaryoten, Viren, Bakteriophagen)
alle teilen gemeinsame Sequenzen und Stuktur-Motive.
Wie erfolgt die Ligase-Reaktion?
in 3 Schritten
- Bildung eines kovalenten Enzym-AMP Zwischenprodukts mit Lysin-Kette des Enzyms
- Übertragung des AMP-Nukleosids an 5' Phosphat des DNA Strangs
- Angriff auf AMP-DNA Bindung durch 3'OH des Einzelstrangs
Welche ist die am häufigsten verwendete DNA-Ligase?
T4-DNA-Ligase
einzelne Polypetid-Kette (68 kDa Molmasse)
pH: maximal bei 7.5-8, 40% Aktivität bei 6.9 & 65% bei 8.3
Ionen: Mg2+ erforderlich
DTT oder Mercaptoethanol erforderlich
Tenperatur: 16° Ideal (oder 4° über Nacht, 30min - ein paar Stunden bei RT)
Wovon hängt die Ligations-Effizienz ab?
von den DNA-Enden
sticky-ends
- effizient weil basen annealing 5' und 3' Ende nah zueinander bringt,
blunt-ends
- ineffizient
- hohe Konzentration von DNA und Enzym erforderlich
- Puffer viskos (z.B. durch PED)
Was macht die T4-Polynukleoitid-Kinase?
transferiert ein gamma-Pjosphat von ATP aus das 5' ENde von Polynucleotide
--> wenn 5'-Phosphat für Ligation fehlt
oder für radioaktive Markierung
Was macht die alkalische Phosphatase?
katalysiert die Entfernung von 5' oder 3' Phosphaten aus Nukleotiden --> OH-Enden entstehen
Zur Behandlung von DNA-Fragmenten die mit RE behandelt wurden vor der Ligation --> keine Reaktion ohne Insert!
Welche Vektoren werden für die Vermehrung in E.coli verwendet?
- Plasmide
- Bakteriophagen
- Lambda
- M13
- spezialisierte Vektoren
- Expressionsvektoren mit tags
- Cosmid, BACS (für große Stücke
Was sind Bakteriophagen?
Viren, die Bakterien infizieren
Nukleinsäure-Moleküle enthält Gene für Phagen-Replikation + schützende, umgebende Proteinhülle = Capsid
Infektion = injizieren der DNA in die Wirtszelle, Phage bliebt draußen
DNA repliziert, Proteine exprimiert, Phage zusammen gebaut & freigegeben
Was ist der Bakteriophage Lambda?
Kopf- Schwanz-Phage
großes lineares Genom
"Stuffer" = Zentralregion des Genoms, kann manipuliert werden
zwei Lebens-Zyklen
- Lytic: replikativ = Phagen werden hergestellt und Zelle lysiert
- lysogen: latent = DNA ins GEnom einegebaut --> an Tochterzellen weitergegeben
Wie können Lambda-Phagen für Klonierung verwendet werden?
- Insertionsvektor
- darf Genomgröße max. um 5% erhöhen
- Ersatz-Vektor
- Ersatz des Stuffers mit target DNA (8-24kb, eukaryotische Gene)
Was ist M13?
filamentöser Phage
einzelsträngiges, zirkuläres Genom (6,4kb)
kann Fragmente bis zur 6x Größe des eigenen Genoms aufnehmen, aber je größer desto instabiler
