Funktionelle Genomforschung
Methoden Microarray, NGS, RNA, DNA, etc.
Methoden Microarray, NGS, RNA, DNA, etc.
Welche Möglichkeiten gibt es für ectopic expression?
- constitutive expression
- IRES
- pDisplay
- Flp-In System
- tetracycline-dependent expression
- ecdyson-inducible expression
Wie funktioniert ectopic constitutive expression?
Trasnfektierte Plasmide enthalten target gene mit eukaryotischen Promotoren, diese werden randomly in das Genom integriert --> Exprimiert
Wie funktioniert ectiopic expression by IRES
über bicistronische mRNA (2 ORFS)
- gene of interest
- GFP
GFP dafür da, um Zellen im Mikroskop sichtbar zu machen. Da sie beide auf der selben mRNA sind werden immer beide exprimiert
Vorteile
- Keine Selektionsmarker notwendig
- FACS-Analyse möglich
Wie funktioniert das Flp-In-System?
Man hat
- Host-Cell Line
- enthält eine Flp recombinase target (FRT) an einem trasnkriptions-aktiven Ort
- Expression Cell line
- Host cell line wird mit Flp-In expression vector und Flp Recombinase expression vector transfektiert
- transient exprimierte recombinase integriert gene von expression vector direkt an der FRT Stelle im Genom
Wie funktioniert die Tetrazyklin-abhängige Expression?
Expression wird mit Vorhandensein von Tetracycline und Derivaten An oder Aus geschalten.
tTA ist ein TF aus
- TetR: Tetrazyklin-Repressor =binding domain
- AD: aus VP16 herpes simplex = Activating domain
Tet-Off
- activates expression in the absence of Dox
- Protein kann nur an Promotor binden, wenn es nicht an Dox gebunden ist
Tet-On
- activates in the presence of Dox
- tTA kann nur an Promotor binden wenn es Dox gebunden hat
Wie funktioniert die Ecdyson-inducible expression?
2 Vektoren
- pVgRXR (both subunits of a Drosophila receptor = constirutively expressed
- pIND
ecdysone-responsive promoter and GoI
Mammalian cells are cotransfected with an inducible expression vector containing your gene of interest and pVgRXR.
In presence of the inducer (ponasterone A or muristerone A) a functional ecdysone receptor binds upstream of the ecdysone responsive promoter element
--> activates expression of the gene of interest.
Ponasterone A: is an analog of ecdysone, an insect steroid hormone that regulates the metamorphosis of Drosophila melanogaster
Welche Möglichkeiten gibt es für gain-of function Mutationen?
- Ectopic expression
- Mutants
Welche Möglichkeiten gibt es Strangbrüche an bestimmten Stellen in die DNA einzuführen?
- Zinc-Finger Nuclease
- TALEN
- CRISPR
Wie funktioniert Zinc-Finger Nuclease Targeting?
Zinc finger nuclease (ZFN) aus 2 Domänen
- DNA binding (Zinc finger modules)
- nuclease domain of Fox I (type II RE)
nur wenn beide vorhanden sind funktionelle (durch transfection eingebracht)
Schneidet den DNA-Doppelstrang
Wie funktioniert TALEN?
= transcription activator-like effector nucleases
Aufbau:
- N-terminale Domäne
- central repeat domain
- Fok I catalytic domain
- central repeat domain
- C-terminake Domäne
Welche Vorteile hat TALEN?
- hohe Spezifität
- geringe off-target Effekte
- kann einfach und schnell für fast jede targte-DNA hergestellt werden
Wie funktioniert CRISPR?
= Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
2 Teile
- a guide RNA (gRNA)
- an endonuclease = CRISPR associated (Cas) nuclease, Cas9
two functional domains: each cutting a different DNA strand (both of these domains are active --> double strand breaks (DSBs) in the genomic DNA)- RuvC
- HNH
base-pairing der gRNA mit der target Sequenz in der genomische DNA rekrutiert Cas9 zur binding site
Felibilität der Basenpaarung kann zu Bindugn an falsche Sequenz führe --> Off-Target cleavage
versions of the Cas9 enzyme containing a single inactive catalytic domain, either RuvC- or HNH-, are called ”nickases”
With only one active nuclease domain, the Cas9 nickase cuts only one strand of the target DNA, creating a single-strand break or “nick”
A single-strand break or nick, is repaired through HDR pathway, using the intact complementary DNA strand as the template
two proximal, opposite strand nicks introduced by a Cas9 nickase and a pair of gRNAs are treated as a Double Strand Break (DSB). A double-nick induced DSB can be repaired by either NHEJ or HDR depending on the desired effect on the gene target
Welche Möglichkeiten zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen gibt es?
- non-homologous end-joning (NHEJ)
- homology directed repair (HDR)
Wie funktioniert NHEJ?
Results in inserts/deletions (InDels) at the DSB site --> frameshifts and/or premature stop codons
InDels induced by NHEJ will be random, so the type and extent of gene disruption will need to be determined experimentally.
The target sequence is selected to introduce a DSB within the first or second exon of the gene (not in introns!)
Wie funktioniert HDR?
Requires the presence of a repair template, which is used to fix the DSB, HDR faithfully copies the sequence of the repair template to the cut target sequence
The DNA template (homology arms, upstream and downstream of the DSB) is transfected into the cell along with the gRNA/Cas9.
Specific nucleotide changes can be introduced into a targeted gene by the use of HDR with a repair template.
Welche Möglichkeiten gibt es für Loss of function auf RNA/Translations-Level?
- Aptamere
- small molecules
- antisense oligonucleotides
- mutations
- RNAi
Was sind Aptamere?
Synthetische 3D-Strukturen aus RNA oder DNA die an target proteine hoch-spezifisch binden.
Herstellung:
- Vektor mit DNA Library
- Exprimiert aPatmere
- Protein das inaktiviert werden soll hinzugegeben
- manche Binden
- der Rest weggewashcne
- gebundene mit PCR amplifiziert
Shritte werden wiederholt bis hocheffizientes Aptamer gefunden wird.
Wie funktioniert Expressions-Inhibition mittels small molecules?
binden oft an katalytische Stellen von Rezeptoren --> Signalwege geblockt --> keine Expression
Aber öfter inhibieren sie die Funktion des Proteins als dessen Expression
Wie funktionieren Antisense-Oligos?
Stören Proteinsynthese durch
- sterische Blockade des 48S-Komplexes
- Bindung von splice-Stellen
- RNAse H mediated degradation (am häufigsten)
Was ist der Vorteil von SAGE und RNAseq?
Auch unbekannte, noch nicht seuenzierte Sequenzen werden miteinbezogen und können analysiert werden
= open system
Was ist ein Microarray und nach welchem Prinzip funktioniert er?
Feste, nicht verformbare Oberfläche mit einem Raster, auf dem man Gene (meist Oligonukleotide oder cDNA) geordnet aufbringt
Jeder Spot trägt 1000de Kopien eines spezifischen Target Moleküls à 3000-32000 Gene pro Chip
Wie werden Microarrays hergestellt?
Spotted Array
- fertig-synthetisierte Sequenzen werden auf den Array gespotted
Oligo-Array
- Sequenzen werden direkt auf dem Array synthetisiert (meist mittels Photolithographic deprotection)
Wie funktioniert die Analyse eines Microarrays?
auf jedem Spot des Microarrays befindet sich ein anderes Gen
Die zu analysierende DNA-Probe wird auf den Microarray gegeben. Probe hybridisiert an den Stellen wo eine komplementäre Sequenz gespotted ist
der Rest wird weggewaschen.
Hybridisierte Sequenzen werden nachgewiesen (je nach Markierung)
Welche Arten von Microarrays gibt es und was analysieren sie?
- Comparative genome hiybridization (CGH)
Vergleich von DNA in gesundem und krankem Gewebe - Differential Hybridization
Vergleich der Gen-Expression in gesundem und krankem Gewebe
relative Genexpressionsstärke - Tiling Arrays
absolute Stärke der Genexpression - SNP-Chips
Analyse des SNP Musters des gesamten Genoms eines Organismus
Wie funktioniert FISH?
= Fluorescence in situ hybridisation
wird verwendet um Sequenz-Abschnitte auf den Chromosomen nachzuweisen (direkt im Gewebe oder Zellkern)
DNA-Sonde wird Fluoreszenz-markiert und dann hybridisiert --> leuchtet = DNA-Sequenz vorhanden
Wie funktioniert RNA-ISH?
= RNA in situ hybridization
Analyse der mRNA Expression spezifischer Gene im Zellverband.
Genspezifische anti-sense Sonde komplementär zur mRNA
Gleichzeitig histologische Untersuchungen des Schnittes --> Expression zu Zelltypen zugeordnet (spezifisches Expressionsmuster)
Wie funktioniert CGH?
Um Duplikationen/Deletionen im Genom zu erkennen
- DNA Proben werden aus gesunden und kranken Gewebe (z.B: Tumor) entnommen
- werden in unterschiedlichen Farben gelabelled (gesund: grün, tumor:rot)
- zusammengemischt
- auf Microarray hybridisiert (Microarray enthält ganzes Genom, oder spezifische Sequenzen
Farbe des Spots analysiert
grün: dieses Gen ist in gesundem mehr vorhanden als im tumor (deletion)
rot: im tumor mehr vorhanden (amplifikation)
gelb: beide gleich viel --> Gen ist nicht spezifisch für den Tumor
wie funktioniert differential hybridization?
zum Vergleich von mRNA Expression zwischen gesundem/kranken Gewebe = relative Expression
- mRNA uas gesundem und krankem Gewebe isoliert und in cDNA revers transkribiert
- fluorescenz oder radioaktiv markiert
kann auf mehrere Arten gescreent werden
- cDNA Phagen-Library (cDNA musste zuvor hineinkloniert werden)
- Microarray (unterschiedlich gelabelled, wie CGH)
Was ist ein Tiling Array?
Misst die absolute Genexpressionsstärke. Um Regionen des Genoms zu untersuchen, die zwar sequenziert, aber deren Funktion noch nicht charakterisiert ist.
Das Genom wird in regelmäßige sich überlappende Abschnitte unterteilt. So wird das gesamte Genom miteinbezogen. Auch non-coding DNA wird in die Analyse miteinbezogen. Statt cDNA werden Oligonukleotid-Sonden verwendet. Einzelsträngig (können auch mit sich selbst hybridisieren)
Werden mit RNA aus verschiedenen Zelllinien und Geweben hybridisiert.
Dadurch das das gesamte Genom auf dem Chip ist, und die gesamte RNA (außer rRNA) auf den cHip gegeben wird, kann man sehen wie stark jedes Gen exprimiert ist.
Wozu wird der tiling arry verwendet?
- Katalogisieren von genetischen Variationen & Polymorphismen (SNP’s, VNTR’s (variable number tandem repeat) und repetitive Elemente)
- Identifikation von unbekannten Exons
- Identifizierung von methylierten Regionen im Genom Die genomische DNA wird mit Natriumhydrogensulfit behandelt, nicht methyliertes Cytosin wird dadurch zu Uracil desaminiert. Dieses bindet beim Hybridisieren nicht an die komplementäre Sequenz, da nur die Basenpaarung U-A und nicht die Basenpaarung U-G möglich ist. Methylierte Sequenzen hingegen binden noch immer sehr gut an komplementäre Sequenzen. Diese können dann durch Analyse des Arrays mit einem Laser detektiert werden
Was ist ein SNP-Chip?
EIn Microarray bei dem die selbe Sequenz aufgetragen ist, nur dass die SNP-Stelle immer woanders ist
- Probe wird aufgetragen
- umso heller es leuchtet, umso besser die Hybridisierung
- umso besser die Übereinstimmung
Je nachdem wie gut die Hybridisierung ist, stimmt das Muster überein
Welche Erkenntnisse können mit dem SNP-CHIP erlangt werden?
- studying slight variations between whole genomes
- determining disease susceptibility
- measuring the efficacy of drug therapies designed specifically for individuals
- SNPs to be used as markers for genetic diseases that have complex traits.
- study loss of heterozygosity (LOH).
Was ist RNA sequencing?
Eine Methode um folgende Fragen zu beantworten
- Was wird exprimiert?
- Welche Gene?
- Welche Allele?
- Wie stark wird exprimiert?
Wie funktioniert RNA sequencing?
- RNA isoliert
- DNA contamination wird mir DNAse entfernt
- RNA wird in short fragments gespalten
- Fragmente werden zu cDNA revers transkribiert
- sequencing adaptors dran ligiert
- fragment size selection (Gel-Elektrophorese)
- Enden der cDNAs werden sequenziert (next-generation sequencing) --> viele kurze Sequenzen
- Wenn beide Enden der cDNAs sewuenziert werden paired-end reads generit
- reads are then assembled into transcripts
- the expression level of each transcript is then estimated by counting the number of reads that align to each transcript
Welche Vorteile bietet RNAseq.?
- High-throughput sequencing
- Auch unbekannte Sequenzen, Entdecken neuer Sequenzen
- Simulatneously map transcribed regions & gene expression
- Distinguish allelic expression
- Low amount of RNA
- Relatively low costs
Was ist SAGE?
Serial Analysis of Gene Expression
Open System, auch noch unbekannte Gene, oder Gene, von denen nicht erwartet wurde, sie vorzufinden, detektiert und ausgewertet werden können.
Ähnlich des RNAseq
Wie funktioniert SAGE?
- Reverse transcription der mRNA
- conversion to double stranded cDNA
- immobilization to streptavidin beads
- Cut all ds cDNA with an anchoring restriction enzyme (AE)
- ligation of linkers that contain a type IIS restriction site
- Cut with the tagging restriction enzyme (TE) (recognition within the linker but cut 10-14 bp downstream (type IIS !)) to make blunt ends
- Ligation of fragments
- PCR Amplification
- Cut with AE
- clone into vector for sequencing
Mit welchen Methoden kann man Sequenzen quantitativ bestimmen?
- qPCR
- SAGE
- RNAseq
- Tiling Array?
Mit welchen Methoden kann man Sequenzen zwischen Gesund/Krank unterscheiden?
- CGH (Gene)
- differential hybridization (Genexpression)
Wie kann man feststellen ob ein Gen exprimiert wird?
- Microarray
- RNA-ISH
-
- 1 / 64
-
Cartes-fiches
Was ist whole genome shot-gun sequencing?
Genom wird einmal in 2000bp und einmal in 10.000bp große Stücke zerschnitten. (damit überlappende Enden entstehen)
die Fragmentt werden in Vektoren kloniert und anschließend von beiden Seiten die Enden sequenziert = paired-end-reads.
die paired-end-reads können durch das überlappen mit den Sequenzen anderer Vektoren in die richtige Reihenfolge gebracht werden = Contigs
Je nach Größe des fehlenden Stücks zwischen 2 paired-end-reads, kann diese Sequenz mit verschiedenen Techniken sequenziert werden.
Was ist paired-end sequencing?
Gene haben paired-end-tags. Die beiden Sequenzen am 3' und 5' Ende sind spezifisch genug, dass sie jeweils nur in einem Gen existieren.
Die entstehenden kurzen reads können zu mate-pairs zusammen gesetzt werden. Diese werden dann mit einem Referenz-Genom verglichen. Dadurch können Inversionen, Translokationen, etc. erkannt werden.
Welche Arten des Gentransfers gibt es?
- DEAE Dextran
positive Ladungen, Endocytose - Calcium-Phosphate
positiv, Endocytose oder Phagocytose - Liposome, Lipoplexe
endocytose, DNA, RNA, Proteine, effizient - Microinjection
transgene Tiere, geringe Anzahl - Electroporation
Embryonic stem cells, schwierig - naked DNA
directly injected, gene gun, not efficient - receptor mediated endocytosis
Molekül mit Rezeptor an Membran, Endocytose
Was bedeute Ectopic expression?
Die Expression eines Gens in einem Gewebe in dem es normalerweise nicht exprimiert wird, oder zu einem Zeitpunkt im Zellzyklus wo es normalerweise nicht exprimiert wird.
Welche Möglichkeiten gibt es für ectopic expression?
- constitutive expression
- IRES
- pDisplay
- Flp-In System
- tetracycline-dependent expression
- ecdyson-inducible expression
Wie funktioniert ectopic constitutive expression?
Trasnfektierte Plasmide enthalten target gene mit eukaryotischen Promotoren, diese werden randomly in das Genom integriert --> Exprimiert
Wie funktioniert ectiopic expression by IRES
über bicistronische mRNA (2 ORFS)
- gene of interest
- GFP
GFP dafür da, um Zellen im Mikroskop sichtbar zu machen. Da sie beide auf der selben mRNA sind werden immer beide exprimiert
Vorteile
- Keine Selektionsmarker notwendig
- FACS-Analyse möglich
Wie funktioniert das Flp-In-System?
Man hat
- Host-Cell Line
- enthält eine Flp recombinase target (FRT) an einem trasnkriptions-aktiven Ort
- Expression Cell line
- Host cell line wird mit Flp-In expression vector und Flp Recombinase expression vector transfektiert
- transient exprimierte recombinase integriert gene von expression vector direkt an der FRT Stelle im Genom
Wie funktioniert die Tetrazyklin-abhängige Expression?
Expression wird mit Vorhandensein von Tetracycline und Derivaten An oder Aus geschalten.
tTA ist ein TF aus
- TetR: Tetrazyklin-Repressor =binding domain
- AD: aus VP16 herpes simplex = Activating domain
Tet-Off
- activates expression in the absence of Dox
- Protein kann nur an Promotor binden, wenn es nicht an Dox gebunden ist
Tet-On
- activates in the presence of Dox
- tTA kann nur an Promotor binden wenn es Dox gebunden hat
Wie funktioniert die Ecdyson-inducible expression?
2 Vektoren
- pVgRXR (both subunits of a Drosophila receptor = constirutively expressed
- pIND
ecdysone-responsive promoter and GoI
Mammalian cells are cotransfected with an inducible expression vector containing your gene of interest and pVgRXR.
In presence of the inducer (ponasterone A or muristerone A) a functional ecdysone receptor binds upstream of the ecdysone responsive promoter element
--> activates expression of the gene of interest.
Ponasterone A: is an analog of ecdysone, an insect steroid hormone that regulates the metamorphosis of Drosophila melanogaster
Welche Möglichkeiten gibt es für gain-of function Mutationen?
- Ectopic expression
- Mutants
Welche Möglichkeiten gibt es Strangbrüche an bestimmten Stellen in die DNA einzuführen?
- Zinc-Finger Nuclease
- TALEN
- CRISPR
Wie funktioniert Zinc-Finger Nuclease Targeting?
Zinc finger nuclease (ZFN) aus 2 Domänen
- DNA binding (Zinc finger modules)
- nuclease domain of Fox I (type II RE)
nur wenn beide vorhanden sind funktionelle (durch transfection eingebracht)
Schneidet den DNA-Doppelstrang
Wie funktioniert TALEN?
= transcription activator-like effector nucleases
Aufbau:
- N-terminale Domäne
- central repeat domain
- Fok I catalytic domain
- central repeat domain
- C-terminake Domäne
Welche Vorteile hat TALEN?
- hohe Spezifität
- geringe off-target Effekte
- kann einfach und schnell für fast jede targte-DNA hergestellt werden
Wie funktioniert CRISPR?
= Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
2 Teile
- a guide RNA (gRNA)
- an endonuclease = CRISPR associated (Cas) nuclease, Cas9
two functional domains: each cutting a different DNA strand (both of these domains are active --> double strand breaks (DSBs) in the genomic DNA)- RuvC
- HNH
base-pairing der gRNA mit der target Sequenz in der genomische DNA rekrutiert Cas9 zur binding site
Felibilität der Basenpaarung kann zu Bindugn an falsche Sequenz führe --> Off-Target cleavage
versions of the Cas9 enzyme containing a single inactive catalytic domain, either RuvC- or HNH-, are called ”nickases”
With only one active nuclease domain, the Cas9 nickase cuts only one strand of the target DNA, creating a single-strand break or “nick”
A single-strand break or nick, is repaired through HDR pathway, using the intact complementary DNA strand as the template
two proximal, opposite strand nicks introduced by a Cas9 nickase and a pair of gRNAs are treated as a Double Strand Break (DSB). A double-nick induced DSB can be repaired by either NHEJ or HDR depending on the desired effect on the gene target
Welche Möglichkeiten zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen gibt es?
- non-homologous end-joning (NHEJ)
- homology directed repair (HDR)
Wie funktioniert NHEJ?
Results in inserts/deletions (InDels) at the DSB site --> frameshifts and/or premature stop codons
InDels induced by NHEJ will be random, so the type and extent of gene disruption will need to be determined experimentally.
The target sequence is selected to introduce a DSB within the first or second exon of the gene (not in introns!)
Wie funktioniert HDR?
Requires the presence of a repair template, which is used to fix the DSB, HDR faithfully copies the sequence of the repair template to the cut target sequence
The DNA template (homology arms, upstream and downstream of the DSB) is transfected into the cell along with the gRNA/Cas9.
Specific nucleotide changes can be introduced into a targeted gene by the use of HDR with a repair template.
Welche Möglichkeiten gibt es für Loss of function auf RNA/Translations-Level?
- Aptamere
- small molecules
- antisense oligonucleotides
- mutations
- RNAi
Was sind Aptamere?
Synthetische 3D-Strukturen aus RNA oder DNA die an target proteine hoch-spezifisch binden.
Herstellung:
- Vektor mit DNA Library
- Exprimiert aPatmere
- Protein das inaktiviert werden soll hinzugegeben
- manche Binden
- der Rest weggewashcne
- gebundene mit PCR amplifiziert
Shritte werden wiederholt bis hocheffizientes Aptamer gefunden wird.
Wie funktioniert Expressions-Inhibition mittels small molecules?
binden oft an katalytische Stellen von Rezeptoren --> Signalwege geblockt --> keine Expression
Aber öfter inhibieren sie die Funktion des Proteins als dessen Expression
Wie funktionieren Antisense-Oligos?
Stören Proteinsynthese durch
- sterische Blockade des 48S-Komplexes
- Bindung von splice-Stellen
- RNAse H mediated degradation (am häufigsten)
Was ist der Vorteil von SAGE und RNAseq?
Auch unbekannte, noch nicht seuenzierte Sequenzen werden miteinbezogen und können analysiert werden
= open system
