Bio-PHZH | Themenkreis 8: Genetik
Anforderungen im Fachbereich Biologie für die Aufnahmeprüfung an die PHZH
Anforderungen im Fachbereich Biologie für die Aufnahmeprüfung an die PHZH
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Lernkarten
Prinzip der PCR
Die Apperatür enthält:
DNA, alle 4 Nucleotidsorten, DNA-Polymerase (hitzebeständig), chemisch hergestellte DNA-Primer (die genau auf die Strangenden passen)
Zyklus 1:
Schritt 1: Erhitzung auf 94°C, Doppelstrang wird aufgebrochen, 2 Einzelstränge entstehen
Schritt 2: Abkühlen auf 60°C zur Bindung der Primer an den beiden gegenläufigenden Enden
Schritt 3: DNA-Polymerase ergänzt bei 72°C DNA-Einzelstrang zu Doppelstrang (Replikation) → aus 1 DNA-Stück sind 2 entstanden
Zuklus 2:
aus 2 DNA-Stücken sind 4 entstanden
Zyklus 3: 8 DNA-Stücke
Zyklus 4: 16 DNA-Stücke
Zyklus 5: 32 DNAStücke
Zyklus 6: 64 DNA-Stücke
…
Zyklus 25: 33'554'432 DNA-Stücke
Pro Abkühlung verdoppelt sich also die Anzahl der gewünschten DNA-Doppelstränge. Diesen Prozess lässt man in automatischen Geräten etwa 25- bis 50-mal ablaufen. Nach 30 Zyklen, sind 230 Kopien entstanden, die nun zu weiteren Untersuchungen z.B. für ein DNA-Fingerprinting zur Verfügung stehen.
Unterschied zur Replikation in Lebewesen
Im Unterschied zur Replikation in Lebewesen, läuft der Prozess der Verdoppelung also hier mehrfach nacheinander ab und der Doppelstrang wird nicht durch ein Enzym (die Helicase) getrennt, sondern durch Hitze!
Kettenabbruch-Methode (DNA-Sequenzierung)
Die Reihenfolge der einzelnen DNA-Bausteine in einem Gen lässt sich durch die Kettenabbruch-Methode bestimmen.
Für die PCR werden dabei von einer Bausteinsorte zusätzliche «Stopper» beigemischt, z.B. Stopp-Guanin. Stopper sind Nukleotide, die dazu führen, dass nach ihrem Einbau kein nächstes Nukleotid angehängt werden kann.
Baut die Polymerase nun zufällig statt eines normalen Guanin ein Stopp-Guanin ein, bricht der Kopiervorgang ab.
Nach der PCR liegen vom zu untersuchenden DNA-Stück viele verschiedene Kopien unterschiedlicher Länge vor, die alle mit einem Stopp-Guanin enden.
Dasselbe macht man in einer anderen PCR mit demselben DNA Stück mit Stopp-Adenin, sodass hier alle Stücke unterschiedlicher Länge mit Adenin enden. In einer dritten PCR gibt man Stopp-Cytosin und in einer vierten Stopp-Thyrnin dazu.
Gelelektrophoresen (DNA-Sequenzierung)
Nun werden die vier Mischungen je in ein Gel gespritzt, durch das Strom fliesst.
Da die DNA-Stücke negativ geladen sind wandern sie im Gel Richtung Pluspol. Dabei wandern die kurzen DNA Stücke weiter als die langen.
Nach der PCR liegt jedes Stück tausendfach vor und man kann im Gel Banden erkennen. Jede Bande steht in der mit Stopp-Guanin behandelten Lösung für ein Teilstück, das mit Guanin endet.
Liegen zwei Banden unmittelbar beieinander bedeutet das, dass zwei Guanins aufeinander folgen, sind die Banden weiter auseinander, bedeutet das, dass hier entsprechend viele andere Basen dazwischen sind. Durch den Vergleich mit den Banden bei den «Gelelektrophoresen» der drei anderen mit Stopp-Adenin, Stopp-Thymin und Stopp-Cytosin versetzten PCRs kann man die genaue Sequenz der Basen ermitteln.
