Biochemie

UTP als E-Träger

Glykogensynthese

• Aktivierung
  • Mit Glc1P
  • wird auf ATP-ähnliches Molekül übertragen (Zuckernukleotid, Uridintriphosphat)
    • Glc1P wird über ihre Phosphatgruppe am C1 an Phosphatgruppe des UTP verknüpft
    • energiereiche Bindung
  • Pyrophosphat (PPi) wird abgespalten und zu 2 x Pi verwandelt
    Glc1P wurde über die Phosphatgruppe am C1 an Phosphatgruppe des UTP verknüpft. UDP (und nicht UMP) wird abgespalten, weil eine P-Gruppe von Glucose und eine von UTP stammt.
    --> Glc1P wird bei Verknüpfung zu Glykogen dephosphoryliert
  • Nettoreaktion: Glc1P + UTP --> UDP-Glc + 2Pi
• Verlängerung
  • n muss > 4 --> mindestens Kette aus 4 Einheiten
  • Beginnt am Glycogenin
  • Verlängerung immer am nichtreduzierenden Ende
  • Glycogensynthase: verknüpft UDP-Zucker mit Glucogen-Ende am nichtred Ende, arbeitet linear

Regulation über

• Phosphorylierung und Dephosphorylierung
  • wird hormonell gesteuert: Adrenalin und Glucagon (nur Leber) erhöhen Blutzucker (regen Glykolyse an), Insulin fördert Glykogensynthese in Leber sowie Muskel.
    • Stress-Reaktion: Kinase aktiviert Glykphosphorylase b in a-Form um
    • Überangebot an Glucose: proteinphosphatase aktiviert b-Form
• Für Abb- sowie Aufbau zwei Systeme: phosphorylierendes und dephosphorylierendes sowie zwei Enzymzustände: a und b 
  • durch phosphorylierung Enzyme ineinander überführbar: a kann zu b werden und umgekehrt (aber glycophosphorylase kann nicht zu glycogensynthase werden!)
  • a Form ist immer schneller als b Form
  • Glykogenphosphorylase a (schneller) fördert Glykogenabbau  
    • ist phosphoryliert, immer aktiv
  • Glykogensynthase fördert Glykogenaufbau
    • ist dephosphoryliert in ihrem a-Zustand

Systeme

• phosphorylierende
  • wird durch cAMP vermehrt aktiviert
    • Kaskade: cAMP aktiviert allosterisch die Proteinkinase A, diese phosphoryliert die Phosphorylase-Kinase, die dann in weiterer Folge die Glycogenphosphorylase phosphoryliert und damit von der b- in die a-Form umwandelt.
• dephosphorylierende
  • funktioniert mit Inhibitor: wird dieser phosphoryliert, inhibiert er eine dephosphorylierende Kinase (diese kann Glycogensynthase aktivieren oder Glycogenphosphorylase inaktivieren)

Lactose: b-Bdg

Sucrose: a-Bdg

Glykolyse in Cytosol
Gluconeogenese:
Pyruvat-->Oxalacetat in Mitochondrium, Oxact muss für weiteren Transport umgewandelt werden. Zwei Möglichkeiten:
1) mitochondriale PEP-Carboxylase wandelt Oxact in PEP um
2)Malat-Aspartat-shuttle

Ziel: Glucose synthetisieren (zB während Hungerperioden) ausgehend von Oxalacetat, das aus Pyruvat hergestellt wird (pyruvat-carboxylase)

Folgende Reaktion sind in Glykolyse praktisch nicht umkehrbar:

• die Umwandlung von Glucose in Glucose-6-phosphat (nur Leber)
  • Lösung: Glucose-6-phosphat wird mithilfe der Glucose-6-Phosphatase zu Glucose
• von Fructose-6-phosphat in Fructose-1,6-bisphosphat (Muskel und Leber)
  • Lösung: Fructose-1,6-bisphosphatase
• die Reaktion von Phosphoenolpyruvat (PEP) zu Pyruvat
  • Lösung:
    1) Pyruvat-Carboxylase: Carboxylierung (=Einbauen von COOH) von Pyruvat zu Oxalacetat unter ATP-Verbrauch
    2) Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase: phosphorylierende Decarboxylierung von Oxalacetat zu PEP unter GTP-Verbrauch

• Transport von NADH aus Cytosol durch innere mitochondriale Membran ins Mitochondrium zu Atmungskette
• Mechanismus Malat-Shuttle: Umwandeln von Stoffen, sodass sie für mitoch.Membran durchlässig werden
  1. Reduzieren von Oxact zu Malat durch Oxidieren von NADH
     • Malat-dehydrogenase
  2. Transport durch Transporter
  3. Schritt 1 rückgängig machen: Oxidation von Malat zu Oxalacetat, NAD+ wird reduziert zu NADH
     --> NADH wird in Matrix angereichert
• Aspartat-shuttle: transportiert keine é
  • Aspartat-aminotransferase (= GOT?)

Ablauf beider Reaktionswege gleichzeitig bedeutet E-Verlust

gegenseitig reguliert: je mehr Glykolyse, desto weniger Gluconeogenese

• Hormonelle Aktivatoren/Inhibitoren wirken auf Enzyme
• wichtiges Zwischenprodukt: Fructose-2,6-bisphosphat
  • Knotenpunkt zwischen beiden Wegen: über Regulierung kann Stoffwechsel gesteuert werden
  • hemmt in hoher konzentration allosterisch die Fructose-1,6-bisphosphatase
• Blutzucker tief:
  weniger F2,6P --> PFK wird inhibiert, FBPase aktiviert

1. Glykolyse im Cytosol
2. Zitrat-Zyklus in mitoch. Matrix
3. Atmungskette (oxydative Phoshorylierung) in inneren Mitochondrienmembran
4. (ATP-Synthase?)

Reduktion: é Aufnahme
Oxidation: é Abgabe

• Vollständige oxidation von Pyruvat zu 3 x CO2,
  • Energie in NADH sowie FADH2 speichern
    • 3 x NADH + 1 x FADH2
  • ein GTP bilden
• Ausgangsstoff: Pyruvat aus Carbs oder Acetyl-CoA aus Fett- und Aminosäuren
  (Acetyl-CoA = "aktivierte Essigsäure", energiereich dank CoA und deswegen reaktiv mit Oxalacetat)
• Nice to know
  • Kein Nettoverbrauch an Oxalacetat, da dieses über jeden Umlauf hinweg regeneriert wird
  • Acetat wird zu Kohlendioxid und Wasser oxidiert
  • B1,B2 und B5 sind notwendige Vitamine für Citratzyklus
  • Energieliefernd sind nur die vier Dehydrierungsschritte (alles Dehydrogenhase-Enzyme) der Substrate
    • Isocitrat
    • alpha-Ketoglutarat
    • Succinat (FADH2)
    • Malat

Import von Pyruvat in MitochMatrix nicht möglich. Pyruvat wird jedoch in innere membran transportiert und muss dort umgewandelt werden, um weiter transportiert werden zu können.

• Pyruvatdehydrogenase wandelt Pyruvat in Acetyl-CoA, NADH und CO2 um
  • Multienzymkomplex: Sehr effizient (Fliessband), Verkettung von Edukt und Produkt von aufeinander folgende Reaktionen
    • bestehend aus drei verschiedenen Enyzmen
    • enthält mehrere Co-Enzyme und prosthetische Gruppen: ermöglicht Regeneration Katalysators

Mechanismus

1. Decarboxylierung: Abspaltung von COO (carboxygruppe) durch Pyruvatdehydrogenase, wird zu CO2
   --> Pyruvat (C3) wird zu C2 Fragment
   Thiaminpyrophosphat (TPP) bildet dabei die prosthetische Gruppe der Pyruvatdehydrog., bindet an C2-Fragment, wird zu Hydroxyethyl-TPP und CO₂.
2. Hydroxyethylgruppe wird zu einer Acetylgruppe oxidiert (gibt H ab) und von Liponamid übernommen. Die Disulfidgruppe des Liponamids wird bei dieser Reaktion zur Disulfhydrylform reduziert (S-Atome nicht mehr gebunden).
3. Regeneration von Dihydroliponamid zu Liponamid:
   FAD wird zu FADH2 reduziert (keine Brücke)
   FADH2 reduziert NAD+ zu NADH wodurch neues FAD entsteht. 

Bildung von Citrat

• Citratsynthase
• Ausgangsstoffe: Oxact + Acetyl-CoA
• zwei Teilreaktionen: 1) Bindung der Ausgangsstoffe 2) Hydrolyse. Dabei 1) Voraussetzung für 2)
• irreversibel
• Citrat kann - im unterschied zu Acetyl-CoA - aus Mitochondrium zur FS-Synthese transportiert werden

Isomerisierung von Citrat zu Isocitrat

• Acontinase
• katalysierte Konformationsänderung

Oxydative decarboxylierung von isocitrat

• Isocitrat-dehydrogenase
• Isocitrat wird zu a-ketoglutarat
  1. Oxidationsschritt: bildung von NADH
  2. Decarboxylierung (von Oxalsuccinat): Entstehung CO2 (das ursprünglich aus aus Oxalacetat stammt. 1 und 2 runde im Citratzyklus nicht identisch!)
  3. (danach nochmal Teilreaktion, Bildung a-Ketoglutarat)

Oxidative Decarboxylierung von a-Ketoglutarat

• a-Ketoglutarat-Dehydrogenase: Enzymkomplex ähnlich Pyruvatdehydrogenase
• Entstehung CO2 (wieder aus ursprünglichem Oxalacetat) und Reduktion von NAD+ zu NADH
• a-ketoglutarat wird zu Succinyl-CoA

Bildung von Succinat

• Succinyl-CoA-Synthetase
• Mechanismus
  1. Succinyl-CoA wird phosphoryliert
  2. Histidin des Enzyms wird phosphoryliert, wodurch Succinat frei wird
  3. Phosphorylierte His gibt P and GDP ab --> GTP

Dehydrierung von Succinat zu Fumarat

• Succinat-Dehydrogenase
• FAD zu FADH2

Hydratisierung von Fumarat zu Malat

• Fumarase

Regeneration von Oxalacetat aus Malat

• eigentlich endergon, durch Verkopplung an Nachbarreaktionen doch "spontan" möglich. Vorallem Citrat-Synthase-reaktion (erste) treibt auch letzte reaktion an.
• Bildung von NADH (somit NAD+ abhängig)

Ziel: Protonengradient

Bestandteile

• Redoxproteine (Komplexe 1-4) inneren mitoMembran
  • können zwischen reduzierten und oxidierte Form switchen
  • sind Mutlienzymkomplexe
  • pumpen p⁺ in intermembranraum --> entsteht Protonengradient
    • Complex I: 4 p+
    • Complex III: 4 p+ via Q-Zyklus (Folge von Redoreaktionen, bei der zwei é von Ubihydrochinon auf Cytochrom c wandern während vier p+ in Intermembranraum und 2 p+ in Komplex III gelangen)
    • Complex IV: 2 p+
• Elektronencarrier: Coenzym Q & Cytochrom
  • Q zwischen 1 und 3, auch von 2 auf 3
    • trägt 2 é
    • lipophil, bewegt sich in Membran
  • Cyt C zwischen 3 und 4, dem intermembranraum entlang
    • trägt nur 1 é
    • trägt Häm-gruppen
    • Cyanid hemmt Cytochrom-c-oxidase in Complex IV, die vier é auf O2 übertragen sollte (änhliche Wirkung wie Sauerstoffmangel)

Mechanismus

• Der é-Lieferant wird immer oxidiert, immer exergon
• é-Fluss entlang zunehmend steigendem Redoxpotential in inneren mitomembran
  • NADH tritt bei Komplex 1 ein, FADH2 bei Komplex 2
  • Abfallprodukt: H2O
  • ROS: unvollständig oxidierter Sauerstoff erzeugt Oxidationsschäden (zB durch HO-Anion/Radikal)
    • Antioxidantien
      • enzymatisch
      • nicht enzymatisch: Vitamin E, C und Gluthation

Bestandteile

• F1: "Lollipop" mit Rotor und Stator, hydrophil, synthetisiert ATP
  • 3 αβ-Untereinheiten, mit identischer Konformation: L, O, T
  • ATP-Synthese: oxydative Phosphorylierung
    1. ADP und Pi binden an L-Stelle
    2. L-->T und ADP + Pi --> ATP, weil Ligand stark gebunden. T katalystisch aktiv
    3. T --> O und ATP verlässt F1, weil O niedrige Affinität für Liganden
    • DNP: macht innere MitoMembran für H⁺ (=p⁺) durchlässig. Annuliert Protonengradienten
    • Kein O2 Vorhanden: NADH/FADH2 --x--> NAD+/FAD, Citratzyklus bleibt stehen (und damit Glykolyse) ==> kein ATP, keine E (=Tod) 
• F0: Transmembranring, in Membran (=hydrophob), transportiert Protonen
  • Rotation durch Konformationsänderung
    p+ gelangt durch hydrophile pore der a-Untereinheit in c-Ring, wo es Bewegung erzeugt. Fast vollständige Umdrehung bevor es zweiten Kanal erreicht und in Matrix entlassen wird
  • Bildung ATP
    • 3 p⁺ pro ATP
    • vollständige Umdrehung des c-Ringes generiert 3 ATP

Nettoertrag

• pro NADH
  • 10 p+ gepumpt
  • 3 ATP synthetisiert
• pro FADH2
  • 6 p1
  • 2 ATP
• Oben aufgetragene Werte sind theoretisch. In Realität tiefer weil NADH/FADH2 für Transport Energie von sich selber nehmen, wodurch ihre tatsächlich auf ATPase übertragbare E schlussendlich tiefer wird.

• limitierende Schritte des Citratzyklus katalysiert durch: Citratsynthase, Isocitratdehydrogenase, a-Ketoglutarat dehydrogenase
• E1 der PDH: katalysiert Pyruvat--> Acetyl-CoA
  • positiv: Insulin
  • negativ: ADP, Pyruvat

Stoffe

• über innere membran transportiert (äussere für diese Stoffe durchlässig)
  • alles von Matrix in Cytosol oder umgekehrt
• ADP/ATP über ANT-antiporter
  • elektrischer Gradient (ATP ist 4-fach negativ geladen)
• Phosphat über PTL-symporter (symport von Pi mit H+)
  • Protonengradient

Fette

• Wasserunlöslich (apolar)
• Energiespeicher
• Membranbestandteil
• Vorläufer Botenstoffen (2nd msg, Hormone)

Arten

• Carbonsäure mit Kohlenstoff-schwanz
  • gesättigt: einfachbindungen
  • ungesättigt: doppelbindungen
    • Essentiell: alpha-Linolensäure sowie Linolensäure (isomere)
  • können zu glycerol verestert werden und anschliessend in triaglycerole sowie glycerophospholipide eingebaut werden

Triaglycerole

• keine Membrankomponente
• Energiereserve in Adipocyten

Glycerophospholipide

• Membranbestandteile mit einem hydrophilen und einem hydrophoben Bestandteil
• Glycerol: vierfach koordiniertes C-Atom
• Phospholipase A₂: spaltet Fettsäuren vom C2-Atom von Phosphoglyceriden ab

Sphingolipide

• Zellmembranbestandteil

Steroide

• Cholesterol
  • häufigste Steroid in Lebewesen
  • Vorläufer Steroidhormonen: Testo & Estradiol

PRPP

• wichtiger Vorläufer für Nukleotide, weil Phosphoribose-Einheit liefert
• R5P aus PPP + ATP ---> PRPP (Ribose mit einem Phosphat und einem Pyrophosphat-Anhängsel) + AMP

Purine: Adenin, Guanin (grosses Molekül, kurzer Name)

• PRPP -->--->de-novo-Synthese--->----> Inosin-5'-Monophosphat (IMP)
  • aus IMP kann GTP sowie ATP gebildet werden. ATP-Synthese unter GTP-Verbrauch und umgekehrt.
• starke Regulierung
  • um N-Atome möglichst effizient zu nutzen
  • um möglichst wenig Abfallstoff der Purinsynthese produzieren: Harnsäure
  • IMP hemmt Amidotransferase (für eigene Synthese)
  • GMP, GDP, GTP:
    • hemmen IMP-Dehydrogenase (für ihre eigene Synthese)
    • begünstigen Adenylosuccinat-Synthetase (für AMP, ADP, ATP Synthese)
  • AMP, ADP, ATP
    • hemmt Adenylosuccinat-Synthetase (katalysiert die Verknüpfung von IMP und Aspartat zu Adenylosuccinat)
    • begünstigt IMP-Dehydrogenase (für GMP-Synthese verantwortlich)
  • Enzyme: GART, AIRC IMPS
  • Hemmstoffe: Sulfonamide legen den de-novo Pfad lahm

Pyrimidine (langer name, kurzes Molekül)

1. aus L-Asp und Carbonylphosphat (aus einer vorherigen, unwichtigen Reaktion) wird mithilfe ATCase ein sechserring synthetisiert: Dehydroorotat
2. Dehydroorotat wird mit PRPP zu UMP (Uracil ist ein Pyrimidin) 

• allosterische Aktivierung durch ATP/PRPP, hemmung durch UDP/UTP

Purinstoffwechsel

• Folsäureanaloga hemmen Dihydrofolatreduktase: Thyminnukleotid-synthese inhibiert
  • Aminopterin
  • Methotrexat
• Sulfonamide hemmen Folsäuresynthese in Bakterien (nicht im Menschen)
• IMP-Dehydrogenase Hemmer: GMP-Synthese gestoppt, DNA/RNA-Synthese dadurch auch gestoppt
  • Ribavirin
  • Mycophenolsäure

Pyrimidinbiosynthese

• 3-Deazauridin hemmt den letzten Schritt der Uracil-Synthese durch Inhibierung der OMP-Decarboxylase
• Cyclopentenylcytosin hemmt CTP-Synthase, die UTP zu CTP umwandelt
• Hemmstoffe der Dihydroorotat-Dehydrogenase: hemmen synthese Orotat aus Dihydrooroat
  • Leflunomid (Arthirits)
  • Atovaquone (Malaria)

RNRase

• Hydroxyharnstoff: Hemmt RNR durch Protonieren dessen Tyr-Radikals
• AZT (Azidothymidin): hemmt reverse Transkriptase in Retroviren (HIV)

Kondensationsreaktion verknüpft, Hydrolyse spaltet AS

Man beginnt immer an N-Terminus

• AS liegen bei physiologischem pH als Zwitterionen vor: Ihre Nettoladung ist 0
  • Aminogruppe protoniert
  • Carboxylgruppe deprotoniert
• Einfluss pH
  • Mehr Säure (pH sinkt): Carboxylat-Gruppe (negativ) wird H⁺ aufnehmen
  • Weniger Säure (pH steigt): Ammonium-Gruppe (positiv) spaltet H⁺ ab 

pKs1 bei ~2.2, \({[COO^-]\over [COOH]} = 1\)--> Die AS wirkt als Puffer

pKs2 bei ~9.4, \({ [NH2] \over [NH3^+]} = 1\)--> ebenfalls Puffereigenschaft

pI bei ~5.5, die AS liegt als Zwitterion vor: sie verfügt über gleich viele positive sowie negative Ladungen.

\(pI = {pKs1 + pKs2 \over 2}\)

a) 2
b) 3-10
c) 11 - 100, linear

Protein:

• Polypeptidkette, allg. ab 40 AS (40 - 4000)
• Molekulargewicht: 4 -440 kDa

110 Da (entspricht 110 u)

• inter-Kette: zwischen zwei Polypeptidketten
• intra-Kette: innhalb derselben Polypeptidkette

Cystein: bildet über Oxidation(Hydrolyse, O₂ muss vorhanden sein) Disulfidbrücken.

• Reduziert: SH
• Oxidiert: S-S

beta-Mercator-Ethanol: löst Disulfidbrücken auf

Analyt affiniert unterschiedlich

• er affiniert hydrophob
• oder hydrophil

und wird deswegen nach seiner Affinität für Lösungsmittel (Eluent, Laufmittel) von anderen Stoffen getrennt.

• Ionentauscherchromatographie
• SDS-PAGE
• Affinitätschromatographie
• Papierchromatographie

Nicht-chromatographische Methoden

• Aussalzen

Trennt nach Löslichkeit

1. Alle AS haben unterschiedlichen pI
2. bei Zugabe von Salz ((NH₄)⁺SO₄^2-) wird die Hydratationshülle der Proteine abgeschwächt, bis sie schlussendlich aufgelöst wird.
3. Den Proteinen bleibt nichts übrig. als sich mit ihresgleichen zu aggregieren (wenn pH = pI wid dieser Prozess begünstigt)
4. Die Proteine fallen fraktioniert aus und können abzentrifugiert werden.

Trennt nach Ladung

Träger (Cellulose) wird modifiziert: er trägt geladene Bestandteile

• positiv geladen: zieht Anionen an --> Anionentauscher
• negativ geladen: Kationentauscher

Trennt nach Polarität

• Analyt läuft mit hydrophobem (=apolaren) Eluenten weiter oder bleibt an hydrophilem (polaren) Träger haften, je nach Affinität
  • Lsg-mittel: Chloroform CHCl₃
  • Träger: Cellulose (CHO)_X

Nachteil: Isolation in grossen Mengen nicht Möglich, rein analytisches Verfahren!

Trennt nach Polarität (eigentlich UNpolarität)

• Wie beim Aussalzen wird Hydratationshülle geschwächt.
• Freigewordene, apolare Bestandteile werden nun von apolaren Bestandteilen von Trägern angezogen 

Trennt nach Grösse und Form

• Kügelchen mit Poren
  • Grosse Moleküle: kurzer Weg --> schnell ausgewaschen
  • Kleine Moleküle: längerer Weg durch Poren --> weniger schnell ausgewaschen

Trennung nach charakteristischen Bindungseigeschaften (wie bsw. Antikörper)

Matrix (Träger) wird mit spezifischen Teilchen (Liganden) bestückt

• Spezifische Teilchen
  • Antikörper
  • Metalle
• Spacer: "Antenne" zwischen Matrix und Ligand

nach Binden von AS + Ligand werden diese nicht mehr ausgewaschen. Sie müssen aber wieder vom Liganden gelöst werden, mittels

• NaCl
• pH-Änderung

Prinzip: Ionen wandern in elektr. Feld

• Anionen zur Anode (+)
• Kationen zur Kathode

Arten

• PAGE: nativ
• SDS-PAGE: denaturierend

AS wandern auf einem Träger durch elektrisches Feld --> Trennung nach Ladung

PAGE:

Zusätzlich werden die AS gesiebt

• Polyacylamid bildet ein Netzwerk mit Maschen, deren grösse bei der Herstellung bestimmt werden kann
• Je nach Grösser wandern AS
  • schneller
    • wenn sie klein sind und problemlos durch die Poren des Netzwerkes passen
    • wenn sie stark geladen sind und deswegen stark von Anode/Kathode angezogen werden
  • langsamer
    • wenn sie gross sind
    • wenn sie netto kaum geladen sind

Trennung nach Grösse bzw. Masse

1. Denaturierung: alle Proteine werden linear ausgerichtet
2. SDS-Molekül
   • Ist stark negativ geladen
   • Schafft Hülle um denat. Protein --> negativ geladenen Hülle
3. im letzten Schritt PAGE anwenden

Man kann DNA oder Protein analysieren

• DNA: über PCR (polymerase chainreaction)
• Protein
  • chemisch: bei Verfahren wird schrittweise N-Terminus-AS abgespalten --> wird erkannt und bestimmten position zugeordnet
  • Massenspektroskopie: ESI-MS
    • Trennen von AS augfrund physikalischen und elektrischen Eigenschaften
      • Die AS befinden sich in einem Gas, ihre Sequenz wurde zerstört --> Je nach Menge best. AS erhält man ein Muster. DIese wird mit anderen in einer Datenbank verglichen.
        (Erstellen dieser Datenbank wäre mithilfe ESI-MS nicht möglich gewesen!)

PAM: Anzahl nicht-lethaler Punktmutationen/100 AS (pro 100 AS damit man unterschiedlich lange Prot verlgiechen kann)

A) Proteine unterliegen Evolution. Bei nicht-lethaler Punkmutation verändert sich eine AS in der Proteinsequenz so, dass das Protein funktionell intakt bleibt. PAM steigt dabei um +1.

Wenn PAM tief ist, sind Mutationen sofort lethal --> der evolutionäre Druck auf die H4-Sequenz ist enorm, die Sequenz ist deswegen hoch konserviert.

Wenn PAM hoch (?) ist, dienen viele AS nur als Platzhalter und wenige davon sind funktionell wichtig. --> Sequenz tief konserviert.