BC.0114

Regulation Cholesterolhomeostase

• proteolytisch
  • SSD: Sterol-sensing-domain der HMG-CoA-Reduktase, in Plasmamembran eingebaut
  • SSD: nimmt Sterole aus ER auf (vermehrt vorhanden je höher [Chol]) --> Bindung Sterol+SSD bewirkt Konformationsänderung
    • Katalytische Eigenschaft der aktive site der HMG-CoA-Reduktase geht verloren: [Mevalonat] sinkt
    • Durch Ubiquitinierung wird HMG-CoA-Redukatse abgebaut
• über Transkription
  • wenig Chol. in ER
    • SSD frei,wodurch Serin-Protease (S1P) a-loop des SREBP (2 TransMembrDomänen) durchtrennt --> basic Helix-Loop-helix kann sich in membran bewegen
    • bHLH erreicht Metallprotease und wird dadurch löslich-->wandert in ZK und bindet an SRE: Transkription von LDL-Rezeptor-genen und HMG-CoA-Reduktase&Synthase--> fördern endogene C-Synthese und verbessern C-Aufnahme
• zelluläre Mechanismen
  • ACAT: Verestern freies Czu CE, das in Lipidtröpfchen gespeichert wird
  • ABCA1
    • Transportprotein
    • bei Tangier mutiert!
    • erhöht [HDL] indem Lipiddomänen auf zellulärer membranoberfläche mit C und Phospolipiden aus Zellinneren angereichert werden. Lipiddomänen speisen HDL

Zusammensetzung Gallenflüssigkeit

• Cholesterin
  • Ausfallen von Cholesterin sobald Gallensäure zu Cholesterin 13:1unterschreitet
• Phosphatidylcholin
• Gallensäuren
  • amphiphil: ermöglichen Lipasen in wässriger Umgebung Fette zu zerschneiden
  • primäre: Cholat, Chenodesoxycholat
    • Konjugiert mithilfe Taurin oder Glycin
  • sekundäre: Desoxycholat, Lithocholat. über Darmfloraaus primären GS synthetisiert
  • zirkulieren im Enteroheptischen Kreislauf 4-10mal/Tag: werden aus Ileum als dekonjugierte GS absorbiert und mithilfe Albumin wieder in Leber geschleust

Dienen beide der Fett und Chol. Homöostase, wirken als TF. Werden über Oxysterolkonz reguliert.

LXL: Liver X receptor

• TF
• erhöht bei hoher [Oxysterol] (oxidiertes Cchol-Derivat) die Cholest-Ausscheidung und trägt dadurch Chol-homeostase bei
• erhöht ABCG5&8 Präsenz in Kanalikuli, die Chol nach apikal ausscheiden

FXR: Farnesoid X receptor (=BAR: bile acid receptor)

• v.a. in Leber und darmtrakt vorhandener Rezeptor für mehrere Gallensäuren
• wirkt als TF nachdem Bindung eingeht
  • synthetisierte Protein (SHP) hemmt Gallensäurenproduktion über Inhibierung der cholesterol 7 alpha-hydroxylase (CYP7A1, schrittlimitierende Enzym)
  • erhöht Menge an MDR2 in Kanalikuli

• Chol überwindet B/H-Schranke nicht --> gehirn verfügt über eigene Chol-Homöostase-Regulation
  • 24S-hydroxycholesterol kann B/H-Schranke bidirektional überqueren
  • Gehirn angewiesen auf CYP46A1, um 24S-hydrox... zu synthestisieren
    • knockout: Lernunfähigkeit bzw Chol-Homöostase im Gehin gestört
• Chol-Quelle: extrahepatische Zellen

Steroidogenese

• viele Hormone/Botenstoffe aus Chol synthetisiert
  • diese binden an nukleäre Rezeptoren, die wiederum TFs rekrutieren --> Chol wichtig für Gentranskriptionsregulation
• in Nenebnnierencortex synthetisiert, über Hypoth/Hypoph. reguliert/sezenriert und über Leber abgebaut

heterotrimerisch

• α,β,γ-UE
  • α
    • GTPase Domäne, ähnlich derjenigen der monomeren G-Proteine
      • bindet GDP in inaktivem Zustand, wird durch GEFs aber aktiviert. GEF kann entwededer der rezeptor selber sein oder vom rezeptor rekrutiert werden (tricky shit!)
    • zusätzlich auch helicale Domäne, heterotrimer-spezifisch
    • dissoziiert vom bety-gamma-Komplex nach Aktivierung
    • kann aktivierend oder inhibierend auf Effektor (Adenylatcyclase) wirken
    • kann durch Cholera- oder Pertussistoxin inhibiert werden
  • βγ-Komplex
    • wird G_βγ genannt, dissoziert nicht vom G-Protein und zerfallen nicht in getrennte β- und γ-UE
    • kann GDI sein: in dem Fall wird G_βγ den G_α nur dann binden können, wenn dieser als G_α-GDP vorliegt
• verschiedene Heterotrimere können mit versch. Rezeptoren interagieren

monomerisch

• zB Ras
• gehen von einer inaktiven, GDP-gebundenen Form im Cytosol in eine aktive, GTP-gebundene Form an der Plasmamembran über

wirken auf: PLC (anderes Kärtchen), Adenylatcyclase (AC), ...?

AC

• positiv: durch GTP-G_sa
  • nach Aktvierung über GTP-Hydrolyse wird Switch II reorientiert, wodurch entstandene Gsa-GDP sich ablöst und keine erneute Aktivierung möglich ist, solange AC nicht reaktiviert wurde (geschieht über andere proteine)
    • Reaktivierung: sobald Ga-GTP zu Ga-GDP hydrolisiert wurde reassoziiert es mit by-Komplex --> Konformationsänderung und GPCR+G-prot ready für nächsten Liganden
    • Phosphodiesterasen degradieren cAMP (hydrolyse)
• negativ: durch GTP-G_ia
  • bindet an andere Stelle als Gsa-GTP
  • hemmt AC-Aktivität durch Reorientieren der katalytischen AS
• AC empfängt Reize mehrerer G-proteine, die in eine einzige Antwort integriert werden

Aktivieren der Phospholipase C (PLC)

• Epinephrin wirkt zb auf Phosphl. C statt auf AC
• kann lipophile sowie hydrophile 2nd messenger generieren:
  • Ausgangstoff: PIP2
    • 2nd messenger: IP3 (hydrophil) + DAG (lipohil, daher membrangebunden)
      • IP3: aktiviert Ca-Kanäle, die bei Öffnung Ca aus ER entlassen
        • Ca (2nd messenger) aktiviert Calmodulin (CaM): ein EF-Hand-Protein, das andere proteine aktiviert
          • Ca-CaM kann an Ca-CaM-Bindedomäne anderer Prot binden und diese dadurch ablösen --> Protein wird aktiviert
      • DAG: aktiviert PSerin undmithilfe von Ca auch die PKC

Aufbau der PLC

• Katalytische X-Y-Domäne
• Bindene Domänen
  • C2-Domäne: bindet Lipophile (Phosphatidylserin, Cholin)
  • EF-Hand: bindet Ca, löst konformationsänderung aus
  • PH-Domäne: bindet versch. Signaltransduktionselemente (PIP2/3, PKC, G_by)

PKA: Proteinkinase A

• Serin-Threonin Kinase
• durch cAMP aktiviert
• generiert Kaskade, die der Aktivierung des CREB (cAMP-responsive element-binding protein) dient

PKB: Proteinkinase B

• zB Akt, wobei Akt ein Onkogen darstellt, das in Tumoren häufig hyperaktiv ist
• upstream an PI3K/AKT-Signalweg gekoppelt
  • Wird dank PH-Domänen über PIP3 an Zellmembran rektrutiert
  • PTEN als Gegenspieler, da PTEN PIP3 durch Dephosphorylierung deaktiviert
• downstream Aktivierung sowie Inaktivierung verschiedenster Enzyme, darunter
  • BAD
    • aktiv: dephosphoryliert, bindet an bcl2, Apoptose findet statt
    • inaktiv: durch Akt phosphoryliert, bindet nicht mehr an bcl2 --> Apoptose inhibiert
  • mTOR
    •  Ser/Thr-Kinase, zentraler Wachstumsregulator
    • wird durch Akt aktiviert, wobei weitere Enzyme zwischengeschaltet sind
    • stimuliert durch Phosphorylierung die Proteinsynthese und hemmt den Proteinabbau
    • Rapamycin hemmt mTOR
      • bei Krebs, wenn mTOR hyperaktiv
      • bei Organtransplantation, wenn IS temporär ausgeschaltet werden muss

PKC: Proteinkinase C

• über Phosph.Serin an Membran gebunden
• benötigt Ca und DAG zur Aktivierung, ist also an PLC gekoppelt
• Phophoryliert verschiedenste Proteine

Ein Beispiel zum Beispiel: Insulin-rezeptor

Aufbau

• Domänen extra- und intrazellulär sowie transmembranär
• Ligand bindet an extrazell Rezeptor --> Dimerisierung und gegenseitige Autophosphorylierung
  • Phoshorylierung aktiviert anderen proteine oder erzeugt Bindestellen für diese
• wichtiges, assoziiertes Protein ist Ras
  • mebranständig, an fast alle RTK gekoppelt
  • Onkogen: hyperaktives Ras in Tumorzellen oft vorhanden
  • Hydrolysiert GTP nur sehr langsam, Aktivitätsdauer des Ras-GTP wird deshalb von GEF oder GAP reguliert

Signaltransduktion: Map-Kinase-Weg

• zytoplasmatische Liganden für RTKs besitzen häufig SH2-Domäne, die an phosphoryliertes RTK binden
  • Grb2 dient als adaptorprotein: verbindet SH2 mit Sos
    • Sos = ein GEF, das auf monomere G-Prots agiert (wie zB Ras): tauscht GDP mit GTP um und aktiviert diese dadurch
• Ras-GTP aktiviert Raf
  • Raf = Ser/Thr-kinase, auch "MKKK" genannt
• MKKK aktiviert MKK
  • MKK = "MEK"
  • MKK können über verschiedene MKKK aktiviert werden
    • Scaffold-Proteine verhindern einschlagen falschen Transduktionskette durch Ordnen der korelierten Kinasen, sodass diese keine anderen, nicht zu aktivierende Kinase, fälschlicherweise Aktivieren (kurz: Kinasen werden ausserhalb Konkurrenz gebracht)
• MKK aktiviert MAPK
  • MAPK = "ERK"
  • agiert auf TFs oder Transkriptionsregulatoren --> Amplifiziert eintreffende, mitogene Signal

• Non-receptor = zytosolische Enzyme, die funktionell wie RTK wirken: Phosphorylieren andere Enzyme (verwenden dafür ATP)
  • meist jedoch in Membran verankert (aber OHNE Rezeptor!)
• interagieren mit versch. RTKs und werden über verschiedene Liganden stimuliert, aber aktivieren immer denselben Pathway --> Sammeln Reize und übertragen diese auf korrekten Pathway

Jak (ehemalig "just another kinase" benannt, die Entdecker hatten sicher auch die Schnauze voll von den ganzen Kinasen!)

• Liganden: Cytokine (INterferone, INterleukine, Chemokine) & Hormone (EPO, Prolaktin, hGh)
  • Zytokin-Rezeptorenm verfügen über keine eigene enzymatische Aktivität --> angewiesen auf JAKs
• JAKs aktivieren sich gegenseitig mit Rezeptoren --> rekrutieren STATs, die Transkription aktivieren

Abl

• bcr-abl-Genkonjunkt ist verantwortlich für chronische myeloide Leukämie, durch unfaire chromosomale Translokation bedingt.
  • in dieser Form Enzym hyperaktiv und unausschaltbar
• gesunde c-abl
  • ist eine non-receptor-Tyrosinkinase
  • kann über RTK sowie NRTKS aktiviert werden

Mechanismus

• Ligand: IGF (insulin like growth factor)
• PI3K katalysiert die Phosphorylierung der 3’-OH Position am Inositolring von bestimmten Phospholipiden in der Zellmembran (Phosphatidylinositolen)
  • Die entstandenen Phosphoinositide, vor allem PIP₃, dienen über PH-Domäne als Andockstellen für weitere Proteine, wie PKB (=Akt) oder PDK1.
  • Der wichtigste Signalweg, den die PI3K so aktiviert ist der PI3K/Akt Signalweg:
    • Deaktivierung des Bad-Proteins, wodruch es sich aus dem Bad-Bcl2-Komplex löst --> Bcl2-Protein daraufhin aktiv und Apoptose inhibiert

Antagonist

• PTEN ist ein Enzym (Phosphatase), das der PI3K-Signalfortleitung durch Dephosphorylierung entgegenwirkt -> wichtiger Tumorsuppressor

Protein-Phosphatasen

• Resetting durchlaufener Signaltranbsduktionspathways ohne PTPs unmöglich
  • Dephosphorylierung über CX₅R-Motif, das sich in konservierter Phosphatase-Domäne befindet
• zB PP2B (=Calcineurin)
  • Aufbau
    • CaNA mit katalytischer Aktivität, Bindestellen für Ca-CaM
    • CaNB mit regulatorischer Funktion, bindet 4 Ca-Ionen
  • Wichtig bei T-Zell Proliferation
• gegliedert in 3 Klassen
  • Rezeptorähnlich
  • Dualspezifisch
  • Intrazellulär
    • zB SHP2: dephosphoryliert RTKs, an die es über pY bindet
      • Autoinhibierung dank D'E-Loop solange nicht an RTK gebunden
• bakterielle PTPs
  • Beulenpest: durch Rattenfloh übertragenes Bakterium inseriert pathogene YoPH-PTP
  • pY wird unkontrolliert dephosphoryliert --> kein Resetting mehr möglich

• SH2/3
  • SH2 erkennt insbesondere Peptide mit phosphoryliertem Tyrosin
  • SH3 erkennt insbesondere prolinreiche Aminosäurenmotive
• PTB
  • Phosphotyrosin-Bindedomäne
  • bindet an phosphoryliertes Tyrosin (aktivierte RTK)
• PH
  • bindet Phosphatidylinositole (PIP2 und PIP3), βγ-subunits und PKC
    • PH-Domänen müssen nicht zwingendermassen alle diese Substrate binden --> werden dadurch spezifisch: zB binden entweder an PTEN oder PI3K
• FYVE
  • verfügt über Zink-Finger
  • Membranständig
  • bindet an PIP3
• C2-Domäne
  • bindet Ca
  • dient der Verankerung in Membran
    • zB in PTEN und PI3K vorhanden

Signalantwort

• Charakteristika wie Dauer, Amplitude und Antowortgeschwindigkeit werden moduliert durc:
  • Halbwertszeit der aktiven Signalmoleküle
    • sehr schnell wenn zB Reizwahrnehmung: kurze Halbwertszeit
    • bei Genexpression langsamere Antwort
  • Feedbackmechanismen
    • positiv:
      • All or none Antwort
      • andauernde Antwort trotz wieder dissoziiertem Liganden --> permanente Differenzierung
    • negativ:
      • schnelle Adaptation dank schnellem Rezeptor-Recycling (Endo&Exozytose)
      • Adaptation an konstante Stimuli kann zu Desensibilisierung führen
  • Signalamplifikation
    • Amplifikation durch 2nd missgis und den ganzen zwischengeschalteten Enzymen zwischen Rezeptor und Zielprodukt

Integration

• PKA
• CaM-kinase
• PKC
• MAP-Kinase
• Akt
  • aktiviert  nur target-Proteine, keinen einfluss auf Genexpression

Antwort

• TFs und -regulatoren
• Zielproteine selber

Bild

• Highliter auf nicht direkt abwärts weitergeleitete Pathways
• PDK1 speziell: stimuliert Akt sowie Zielproteine

Grundprinzip: Aufbau & Trennungsprinzip

• Trennung aufgrund m/z (Masse/Ladung) --> Moleküle gleicher Masse wären sonst nicht voneinander unterscheidbar
  • Proteine gleicher Masse und Ladung sind nicht unterscheidbar. Werden diese jedoch in einzelen Bestandteile getrennt, ist eine Unterscheidung möglich.
  • Posttranslationelle Modifikationen beeinflussen die Aktivität eines Proteins (zB Phosphorylierung) --> Diese Modifikationen sind messbar und dadurch kann Aktivitätszustand des Proteins identifiziert werden
• Ionisierungsquellen
  • softe Ionenquellen: verändern/degradieren Biomoleküle nicht, befördern diese dennoch in die Gasphase
    • MALDI: Ionisier Biomoleküle über einen Laser (Photo-ionisierung), die in Gasphase übergehen. Matrix dient als Puffer.
    • ESI: Electrospray Ionisation (tiefer pH mit vielen p+ um Pseudoionisierte-Moleküle zu generieren)
  • Ionisierung durch Protonierung generiert ein pseudo-molecular-Ion, dessen Masse vom natürlichen (nicht protinierten) Protein abweicht.
• Massenspektrometer: Detektieren Menge Protein, die einer best. m/z entsprechen
  • Massenspektrometer: 1x10^-12 ±1x10^-18 g entspricht Genauigkeit x Sensibilität
  • vor Spektrometer: in Gasphase stossen sich die gleichgeladenenen Teilchen ab
  • Quadrupole
    • Ionenstäbe (4, davon zwei gegenüberstehenden gleich geladen) wechseln Ladung unter best. Frequenz --> Flugbahn Moleküle variiert je nach Frequenz, Kontakt Molekül und Stab führt hingegen zu Degradation
  • Time-of-flight
    • MALDI linear-time-of-flight: Auftrennung nach Flugzeit, unidirektionelle Flugbahn

Ableitbare Aussagen

• Molekulare Masse
• Struktur identifiziert
• elementare Komposition inklusive Isotope
• Menge eines Proteins im Verlgleich zur Gesamtheit der analysierten Proteine
  • Detektion ist Konzentrationsabhängig --> so wenig Lösungsmittel wie möglich verwenden

Tandem-Massenspektrometrie:

• mehrere Massenanalysatoren aneinander gekoppelt --> isolieren bestimmte Gasphaseionen
  • Durch Selektivität wird Sensivität entscheidend verbessert
  • in BMS grundsätzlich immer MS/MS
    • meist tripple Quadrupol

• Trypsin: Proteinverdau zu Peptiden, die für MS praktischer sind
  • ESI verwendet Trypsin
  • Davor werden einzelenen Proteine (Proteine! nicht Peptide! also vor dem Verdau) mittels PAGE getrennt
    • Nur die Probe eines einzelnen Proteins wird verdaut und dann "massenspektometrisiert" --> sobald zwei verschiedene Proteine gemessen werden, ist es unmöglich aus den Peptiden herabzuleiten, um welches Protein es sich ursprünglich handelte.
  • zT werden Proteine nicht ganz verdaut --> missed cleavage sites
    • Fragmente besitzen nicht alle N- und C-Terminus, da sie nicht immer an Peptidbindung brechen (i.d.R. aber schon)
      • Wenn sich die Ladung am C-Terminus befindet, heisst das Ion ein a/b/c/... Ion
      • Wenn sich die Ladung am N-Terminus befindet, heisst das Ion ein x/y/z... Ion

Metabolic labeling

• SILAC (Abkürzung von stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture) ist eine massenspektrometrische Methode zur Mengenbestimmung durch Isotopenmarkierung.
• SILAC wird in der Proteomik verwendet.
• Prinzip: Proteine werden in Zellen auf Nährmedien synthetisiert, die einerseits normale Atome, andererseits nur Isotope enthalten --> identische Proteine werden dadurch unterscheidbar, weil die Atome, die sie ausmachen, in einem der beiden Fälle schwerer sind.
  • Die Proteine werden in derselben Probe massenspektrometrisisisisisiert
  • Sinn und Zweck: messen von Ereignissen der Signaltransduktion

Struktur

• 4 myoglobinähnliche Untereinheiten, die je ein O2 aufnehmen
  • gen. Codierung Myoglob und Hb unterschiedlich, deswegen nur "ähnlich"
• zwei α und zwei β Einheiten
  • Heterodimere (αβ) ziehen sich durch hydrophobe WW an, Homodimere (αα/ββ) stossen sich ab
    • --> Ausbildung zentralen Kanals in Hb-Molekül
    • Mobile a/b-Ketten Kontakte, die bei O2-Aufnahme verschoben werden können
  • F- und E-Helix: Abschnitte der alpha/beta-Globinketten
    • F: trägt proximales His und kann Fe weiter in Porphyrinring schieben
    • E: trägt distales histidin
      • Vor O2-Aufnahme: Protonenfalle, Schützt vor Oxidation
      • Nach O2-Aufnahme: Stabililsiert Fe-O2-Bdg
• Hb unterliegt codierungs- und funktionell bedingter Strukturänderungen
  • genetisch: HbA/HbF --> Fötus exprimiert andere Sequenzen als Adult
    • Proteine stammen aus unterschiedlichen Chromos. werden posttransl. zusammengefügt
  • funktionell: Konformationsänderungen für optimale O2-Aufnahme und O2-Abgabe --> Shape-shifting
    • zwei Zustände zwischen a1 und b2 (bei Kontaktfläche) mit identisch vielen H-Brücken (pH abhängig!), jedoch um 3 AS versetzt. (T- und R-Form siehe Kooperativität)
    • Verschiebung entlang der kürzeren Strecke zwischen Globinketten, weil diese einfacher mobilisierbar sind
• Häm: Grundsätzliche Funktion ist O2-Transport zur E-Gewinnung
  • nichtkovalent über hydrophobe Tasche an Globinketten gebunden
  • ist eine prostetische Gruppe

Shape-Shifting und Kooperativität

• Bedingt durch pH-Änderungen sowie O2-Abgabe und CO2-Aufnahme
• Übergang von einem Zustand in anderen: α₁β₂- und α₂β₁-Kontakte werden verschoben, wobei sich α₁β₁ bzw. α₂β₂ Dimere um 15* drehen --> zentrale Kanal wird bei Oxygenierung kleiner
  • Verzahnungen α1β2 werden verändert (kürzere der zwei Distanzen zwischen Ecken, nur zwei Zustände möglich:
    • R-Zustand (relaxed): OxyHb
      • kleines Loch, BPG wird immer herausgepresst
      • hohe Sauerstoffaffinität
      • Fe(II) (=Fe³⁺ wenn O2 gebunden! Dank Proton des prox His wird Fe(III)-O2-Addukt stabilisiert) gelangt nur in Porphyrinebene, wenn sich prox His verschiebt --> prox His fest an F-Helix, die sich bewegen muss, wenn Oxydation stattfindet.
        • a1b2-Kontakte verschieben sich, wohingenen a1b1/a2b2-Dimere starr sind.
    • T-Zustand (tense): Deoxy Hb
      • grosses Loch in zentralem Kanal
      • tiefe O2-Affinität, wird durch BPG zusätzlich stabilisiert
      • Fe ausserhalb Ebene des Porphyrinringes
      • Durch Ionenbindungen stabilisiert, die bei Übergang in R jedoch aufgebrochen werden
        • diese sind pH abhängig (Bohr)
        • machen T stabiler als R
  • Kooperativität: allosterisch bedingt
    • strukturelle Veränderung einer alpha/beta-Untereinheit wird Kontaktflächen so beeinflussen, dass anderen Untereinheiten eine höhere O2-Affinität aufweise --> Bindungskurve Hb-O2 genau deswegen sigmoid
      • unabhägig voneinander können Dimere oder Untereinheiten ihre Konformation nicht ändern, weil sie über die zwei Zustände der a2b1-Kontakt verbunden sind
      • Wenn eine Untereinheit O2 bindet, muss sie im T-Zustand verharren, bis zweite Untereinheit ebenfalls O2 aufnimmt. Dann können beide in R-Zustand wechseln

Wichtigkeit von Enzymen und Stoffen: Affinität O2-Hb ohne Shape-shifting oder BPG immer gleich! Modulieren der Affinität heisst O2-Aufnahme und Abgage ermöglich, ist also unverzichtbar!

• CA: verhindert durch Umwandlung von CO2 in H2CO3 den lethalen Transport von ausgeperltem CO2 (zerreisst Kapillaren)
• Shape-Shifting: Bindung O2 begünstigt bindung zusätzlicher O2-moleküle an dasselbe Hb-Molekül
• pH: mit tieferem pH nimmt O2-Affinität ab (Bohr) --> kann besser abgegeben werden
  • Ketteneffekt: erste Hb gibt bei CO2-Aufnahme ein Proton ab, das Ungebung ansäuert. Folgenden Hb können CO2 dadurch besser aufnehmen.
• CO2: mit steigender [CO2] nimmt O2-Affinität ab
  • In Muskeln und Peripherie wichtig, da dort [CO2] hoch
• BPG: mit steigender [BPG] nimmt O2-Affinität ab
  • Für Höhenaufenthalt wichtig: Hb arbeitet statt mit 4-2 mit 3-1 Sauerstoffmolekül(en)
    • Sauerstoffabgabe an Gewebe bliebt identisch/ausreichend (Differenzen schliesslich gleich)
    • Kompensation durch EPO: Problem: PO2 sinkt in Höhe und BPG senkt O2-Affinität --> Widerspruch. Jedoch wird dank mehr RBK bzw mehr Hb die verminderte Affinität zu O2 kompensiert. Es wird weiterhin genug O2 aufgenommen und trotz tiefer P_baro bzw PO2 dank niedriger Affinität an Gewbe gelifert. 
    • Kopplung Atmung und Glykolyse: BPG (2,3-BPG) stammt aus 1,3-BPG
  • bei Foetus
    • O2-Affinität hoch, wohingegen BPG-Affinität tief ist

Modelle

• sequentiell: induced fit --> Affinität modullierbar
• symmetrie
  • Obwohl Untereinheiten unterschiedlich (widerspricht symmterie Modell), sind diese doch ausreichend ähnlich
• Übersetzung von durch gebundenen Liganden induzierter Konformationsänderung auf benachbarte Untereinheitem ist von der Kopplungssträke abhängig
  • konzertiert (schwach) stimmt mit Symmetriemodell überein
  • Gleichzeitig r und t --> Widerspricht Punkt 4

sd

• Geschiwndigkeit und Spezifizität: schnellere Aufnahme meist Indiz für vermittelten Transport , zB Glucose
• Sättigung:
  • Diffusion von Konzgrad abhängig
  • gegen Diffusionsgradient heisst vermittelter Transport
• Kompetition
• Inaktivation: Hemmen von vermitteltem Transport bzw. involvierten carrier Proteinen

dank voltage gated Ionenkanälen

• Ungleichvertilung Ionen verantwortlich für Ruhemebranpotential
  • Na:Depolarisation
  • K: Re- und Hyperpolarisation
• Unidirektional dank Refraktärperiode
  • Ionenkanäle besitzen zwei gates --> eine dient Autoinhibition (auch voltage gated)

• Problem: H3O+ darf nicht in Zelle gelangen, sonst wird pH_intraz gestört
• Asp innerhalb der Aquaporine: Überträgt H-Brücken einzelner H2O-Moleküle auf sich. Dabei bleibt Dipolcharakter der Moleküle erhalten, das H-Brücken-Netz jedoch wird aufgelöst und H3O+ dadurch keine Chance zum Passieren gegeben.

• AS-Sequenz stark konserviert. Variation einer AS führt bereits zu Funktionsbeeinträchtigungen und vermindert Lebensdauer der RBK
  • Hämolytische Anämie: Verkürzte Lebendsdauer heisst Erythropoiese muss ständig erhöht sein --> Knochenmarks und Wachsumsstörungen
• interne Mutationen:
  • Hammersmith: Pyrrolring gestört, Häm instabil
  • Bristol: ähnlich Hammersmith
  • Bibba: Prolin, der guta alte Struktubrecher
  • Savanna: winziges Gly zu enormes Valin ersetzt. Neue Konformation der E und F-Abschnitte der Helix bedingt durch weniger frei verfügbaren Raum
• oberflächliche Mutationen --> Sichelzellanämie
  • Flexibilität durch Faserbildung beeinträchtigt: Ablauf ähnlich einer Kristallisation und wird begünstigt durch
    • tiefe Flussrate in Peripherie
    • Dehydratisierung des Betroffenen
    • tiefen pH
  • Nukleationsphase: Bildung Fasern nimmt exp. zu
  • Nur ein Teil der genetisch modofizierten Hb tatsächlich sichelzellförmig: DeoxyHb
  • genetischer Fehler: GluA3(6)ß -> Val
  • Malariaresistenz von HbS dankt tiefen intrazellulären [B]

Bioverfügbarkeit abhängig von Dosierung sowie Pharmakokonetik

• Sepzifische medis: maximale Dissoziationskonstante bei 1µM heisst: W(irkstoff) + R(ezeptor) ⇌ Wirkstoff-Rezeptor-Komplex (WR) mit Gleichgewicht WR bei ≤ 1µM
• Müssen biologischen Bedingungen und Umfeld angepasst sein
  • Säure Magen
  • Oxidation Leber
    • Medis Scheitern hier oft weil menschliches Cytochrom P450 und dessen Isoenzyme enorme unterschiede in Zusammensetzung aufweisen --> Jeder Mensch detoxifiziert anders
    • Oxidation beschleunigt Ausspülen druch Niere
    • Kann Funktion annulieren oder worst case sogar aus Medi toxische Substanz generieren
  • transportierbarkeit: durch Darmwand, durch Kapillaren, durch Zielzelle evtl sogar durch Blut-Hirn-Schranke
  • Bindung an nicht-traget muss schwach sein: Festsetzen Medikaments in Adipocyten
• Dosierung --> Therapeutisches Fenster: Effizienz sowie Toxizität beiderseits abhängig von Dosierung. Therap. Fenster zeigt, un welchen Dosierungen Medi verträglich und wirkungsvoll ist

Scheitern

• Interaktion von Medikamenten werden an reinen Proteinen simuliert. In vivo intergaieren 10'000 weitere Proteine/Enzyme mit Medikament. --> off target effects
• Drug-Drug effekt identisches problem, nur neben 10'000 natürlichen Substanzen noch etliche weitere Medikamente im Körper. (Patient mit Krebs oder sogar Diabetes nimmt bis zu 8 Medikamente gleichzeitig --> Medikamenten Orgie)

Bild:

• Pharmakodynamik: Einfluß des Arzneimttels auf den Organismus
• Parmakokinetik: Einwirkung des Organismus auf ein eingenommenes Arzneimittel in Abhängigkeit von der Zeit
  • beeinflusst Bioverfügbarkeit

high-throughput screening zeigt, welche potentiellen Stoffe mit einem Stoff, zB Enzym, interagieren. Dimensionen sind enorm (mehrere hundert tausend Stoffe getestet mit high-tech IT-geräten und robotern)

Phasen vgl Bild

CMF: Chronic Myeloid Leukemia

• Genetisch bedingt: durch fehlerhafte gene ein funktionell intaktes Protein translatiert, das an alle BCR-Rezeptoren bindet und dort auch noch dank tyrosinkinase-site (ABL) site alle diese phosphoryliert --> Konstanter Wachstumsstimulus, Leukämie
• Gleevec (Imatinib) passt genau in aktive site des Proteins, das dadruch inhibiert wird
  • Mutationen der ABL-Site erzeugen Gleevec-Resistenz --> andere Medis nötig (auch ein Grund, warum Medikamente Scheitern: Resistenzbildung dank Mutationen bzw Einlschlagen neuer pathogener Pathways behandelter Zellen)

Tumorzellen

• BRaf Zelle mutiert zu BRAF-V600E und bleibt durch Mutation immer in aktiver Form gefangen
  • nicht mehr regulierbares Wachstum
  • BRAF-V600E kann inhibiert werden --> Einschlagen neuer Pathways

• Hauptenergiequelle Körpers
• Eigenschaften
  • Können in Leber remodeliert werden
• Arten
  • Triaglycerol: hydrophob, (l)/(s) je nach Sättigungsgrad
  • Glycerophospholipide: tragen ladungen, deswegen hydrophob und -phil
    • Bausteine Bilayers --> Flüssigmosaikmodell dank gesättigten und ungesättigten FS

exogener Weg: durch Nahrung aufgenommene Fett, das über Lymphe in Blut übergeht bis schlussendlich in Leber (blauer pathway)

• Fett --Gallensalze--> Micell aus Triacylglyceriden --Pankreas-Lipase--> einzele Fettsäuren, können über Darmmucosa in Enterozyten aufgenommen werden.
  • Pankreaslipase
    • Aktivation erst bei Andocken an fettige Phase --> funktioniert nur an Phasengrenze zw. Fett und Wasser
    • Katalytische Triade formt hydrophobe active site, die durch lid abgedeckt wird. diese wier wiederum durch Colipase bei Aktivierung der Pankreaslipase verschoben
    • Durch Orlistat gehemmt
• Aufnahme verschiedener Stoffe in Enterozyten
  • Fette: werden als einzelne FS über mucosa aufgenommen und intrazellulär weiterverarbeitet durch:
    • I-FABP: intestinal fatty acid binding protein
      • Schützt die einzelnen Bestandteile
      • Setzt FS wieder in TAG zusammen, die zu Chylomikronen werden --> in Lymphe transportierbare, H2O-lösliche Form von Fett
  • Cholesterin
    • Cholesterine und pflanzliche Sterole werden über NPC1L1 augenommen
      • pflz. Sterole über spez. ABC-Kassetten wieder in Lumen rausgepumpt
        • Sitosterolämie: genetisch bedingtes fehlen der ABC-Kassetten --> Anreicherung pflanzlicher Sterine im Körper
      • Ezetimibe hemmen Cholesterolaufnahme durch Lahmlegen von NPC1L1

Endogener Weg: Aus Leber stammendes Fett, geht zur Peripherie

• VLDL aus Leber wird in Peripherie zu IDL und LDL

reverser Cholesteroltransport: von peripherie zur Leber

• HDL

Transport erfolgt über Lipoproteine (Grundsätzlich: je tiefer Dichte desto höher Lipidgehalt)

• Aus Darm
  • Chylomikrone
    • Clearance: ca 8min --> schnell verwertet
    • -remnants: Chylomikronen, die FS an Muskel/Adipozyten abgegben haben und in Blut zurückbleiben. Weisen höheren Cholesteringehalt auf.
• Aus Leber
  • VLDL: enthält TAG (und nicht freie FS!)
  • LDL: zirkuliert in Plasma, speichert v.a. Cholesterin
• Aus extrahepatischen Zellen (Muskeln, Adipozyten)
  • HDL: proteinreich
    • in Hungerzustand wird durch HSL (homrone-sensitive-lipase) und ATGL (Adipozyten-Lipase) freie FS in Blutstrom entlassen, die mit Albumin transportiert werden.
      • Insulin hemmt, Adrenalin fördert HSL
      • Clearance: ca. 20 Tage

Fett wird in Lipoproteinen transportiert, die dank Apolipoproteinein (=Apoproteinen) erst löslich werden. Dabei ist Apolipoprotein ein Bestandteil des Lipoproteines, d.h. ApoB100/48 sind Bestandteil von VLDL/Chylomikronen

• Lipoprotein: Mono-Phospholipidlayer
• Durch Apo B100 oder B48 bedeckt, je nach exogen/endogenem pathway bzw. Bildungsursprung des Apolipoproteines
  • selbe Gen, durch Editing in Darmzellen verändert und nur 48% Sequenz translatiert
  • bestehen aus a-Helices mit polarem und apolarem Bestandteil --> Bindestellen
• Funktion:
  • Für Bildung der Lipoproteine zuständig
  • Katalytische Funktion
    • Aktivatoren: ApoA1 von LCAT (verestert Cholesterin); ApoC2 von LPL (zersetzt TAG zu FS)  
    • Inhibitoren: ApoA2 von HTGL (=hepatic TGA lipase, das TAG in Leber zu FS spaltet)
  • Bindungseigenschaften: dienen als Bindungs- und Erkennungsmolekül
    • vgl Bild

vgl Bild

ab p.33 weitermachen