Bakteriengenetik Teil 8

• Cis: lokalisiert auf Genom; Bindestelle für Aktivator/Repressor

• Trans: kann sich durch Diffusion bewegen; Proteine/Repressoren

• Aktivatorbindestelle: upstream der DNA-Polymerrase bei max. ~ -40 (Bending der DNA zur Aktivatorfunktion möglich à weiter weg von Transkriptionsstart)
• Operatorbindestelle: downstream bei ~ +1 (Interaktion mit Polymerase)

d

• Catabolite-Activator-Protein
• CAP bindet an DNA und bewirkt eine Krümmung der DNA um ungeähr 90° (Bending). Dadurch verändert sich die Lokalisierung der DNA-bindenden Proteinen zueinander, wodurch die Polymeraseaktivität erhöht wird. Zum anderen sorgt die entstehende Spannung im DNA-Molekül dafür, dass die DNA-Stränge besser dissoziieren, wodurch die Polymerase besser arbeiten kann.
• Nimmt die Glukosekonzentration im Nährmedium ab, so erhöht sich die Konzentration an cAMP. Diese bewirkt eine Aktivierung von CAP, wodurch das Lac-Operon verstärkt abgelesen wird und das Bakterium daraufhin auf andere C-Quellen zurückgreifen kann. Ist genug Glukose vorhanden, so ist nicht viel cAMP vorhanden und das Lac-Operon wird nicht aktiviert.

2 Ursachen:

• Mutation im lacI^- (Repressor): lac-Operon immer aktiv, Repressor kann nicht mehr binden
  • Beleg durch Komplementierung à Konstruktion eines Diploids durch Plasmid, welches intaktes lacI trägt (partielles Diploid)
• Mutation im Operator: Repressor erkennt Bindestelle (Operator) nicht mehr
  • Revertante: Mutation wird rückgängig gemacht
  • Reportergen als Indikator: Transformation des Operators hinter Reportergen (Luciferase/GFP); bei Mutation Expression des Gens (keine Repression)

• Allolactose = Induktor-Bindestelle des Repressors mutiert
  • Komplementation des Repressors in trans über Plasmid (partielles Diploid)
• ß-Galaktosidase mutiert: keine Lactose zu Allolactose
  • Komplementation des beta Gal in trans über Plasmid (partielles Diploid)
• Promotormutation
  • Revertante: Promotor rückmutiert

Eine Komplementante ist eine Mutante, die trotzdem wieder den Wildtyp-Phänotyp aufweist. Dies wird erreicht durch Transformation der Mutanten mit einem Plasmid welches das Wildtyp-Gen des mutierten Gens der Mutante trägt. Auf diese Weise wird die Mutante „gerettet“

Durch EMSA (Electrophoretic mobility Shift Assay à Basierend auf DNA Fingerprinting)

• Inkubation von Repressor und Proteinen (Konzentrationsgradient) mit DNA-Fragmenten (Restriktionsenzyme) und anschließende SDS-PAGE (Verdünnungsreihen für  K_s-Wert-Ermittlung) à 1. Ansatz ohne Proteine, 2. Ansatz mit Inkubation (Vergleich)
• Bei Bindung des Proteins an einen gewissen DNA-Abschnitt verändert sich dessen Laufzeit à Operatorbindestelle lässt sich ermitteln
• Sequenzierung des Fragments welches Repressor bindet

• Visualisierung des Repressors durch GFP-Fusion
• Aktiv: Lokalisierung am Chromosom
• Zugabe von Induktor: Verteilung in der gesamten Zelle

• Repressor: Bindet an Operator und verhindert auf diese Weise, dass ein Gen abgelesen werden kann (Transkription wird inhibiert). Corepressor + Aporepressor = Repressor (aktiv)
• Corepressor ist ein Molekül, welches an den inaktiven Repressor bindet und ihn dadurch aktiviert (negative Repression). Corepressor kann außerdem an den Aktivator bindet und ihn dadurch inaktiviert (Positive Repression)
• Aporepressor ist ein Repressor, an dem der Corepressor noch nicht gebunden ist à inaktiv

• Bending der DNA um ca. 90° à dadurch Veränderung der Lokalisierung der DNA-bindenden Proteine zueinander; Spannung im Molekül

• Inaktivierung:
  • Trapping: RNA-Polymerase und Transkriptionsstart gefangen (Einschluss) durch Polymer, das an DNA vor und hinter der RPo bindet und einen Loop erzeugt
  • Silencing: Inhibierung des RPo-Zugangs auf DNA durch Bindung eines NAPs
• Aktivierung:
  • Transkriptionsaktivierung durch RNAP-Kontakt; NAP bindet an RPo und aktiviert
  • Loop-vermittelte Aktivierung durch RNAP-Kontakt, Interaktion räumlich entfernter Regulatoren mit RPo (1x zur Loop-Bildung, 1x zur RPo-Bindung)
• globale DNA-Topologie
  • Ausbildung globaler Strukturen (DNA-wrapping, DNA-Verbrückung und Loops à Supercoil)
• Hairpin-Bildung
  • bei Vorliegen von Inverted repeats und ssDNA (selten)
  • Bindung von TF oder RPo an hairpin 

• Trapping: Ausbildung einer Loopstruktur durch Binden eines Tetramerrepressors vor und hinter der RPo-Bindestelle = des Promotors
• Silencing: Binden des Repressors in der Nähe des Promotors und Verhinderung der Interaktion zwischen Promotor und der RPo

• lokal durch sliding (entlang DNA) und hopping (lösen und wieder Binden an beachbarten Loci)
• global durch jumping (Wechsel des TF an weit entfernten Loci durch räumliche Nähe von Locis durch supercoiling, hairpins etc.)

• Modell des direct displacements: TF oder Repressor löst sich nie vollständig von der DNA
• Target-Finding (Bindestelle) von TF/Repressor nicht durch Diffusion, sondern durch direct replacment à da Bindung an falscher Stelle (durch z.B. Überschuss)
• Induktor führt zum Abfall des falsch gebundenen Repressors von Operator und zufälliger Bindung auf DNA à Entfernung des Induktors führt zur Bindung des vorher inaktiven Repressor an die richtige Bindestelle (zum richtigen Operator

• Curved DNA (an Spitze von Supercoil)
• Plectonemic Supercoils (normal gezwirbelt, unrestrained)
• Toroidal Supercoils (z.B. um Protein, restrained)
• DNA wird komprimiert

à Entwundende Regionen können besser abgelesen werden; Regulation möglich

Bei Prokaryoten ist die Translation direkt mit der Transkription gekoppelt. Nach der Synthese des Transkriptionsfaktors kann dieser dann direkt an seinen Operator binden. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, dass der TF direkt seinen Bindungsplatz finden. Bei Eukaryoten macht dies keinen Sinn, da die mRNA zunächst aus dem Zellkern diffundiert um im Cytoplasma translatiert zu werden

• 2 stabile Zustände eines Gens während der Expression: on/off à kein Intermediat
• Stochastische Weitergabe der Regulation an Nachkommen (entw. on oder off) à nur einige wenige Zellen einer Population besitzen aktiven Promotor = Bistablität
• bei Überschreitung eines Regulatorkonzentrationsschwellenwert kommt es zu einem exponentiellen TF-Konzentrationsanstieg, da der TF seine eigene Transkription stimuliert à Autoregulation
• Auf Grund dieses Phänomens gibt es immer Individuen in einer Population, die anders reguliert sind als ihre Artsgenossen. Bei plötzlich auftretenden Umweltschwankungen überleben dann diese Individuen, die schon vorher daran angepasst waren. Diese Aufgabenverteilung in der Population ist eine Evolutionsstrategie, die man „bet-hedging“ nennt und welche man zB bei Sporenbildner gut beobachten kann (manche Individuen bilden dauernd Sporen aus)