Génétique médicale
Prof Caignec - 3 Cytogénétique moléculaire
Prof Caignec - 3 Cytogénétique moléculaire
Combien de sondes subtélomèriques différentes ?
On a 23 paires de chromosomes (22 paires autosomes et 1 paire gonosome). Pour les autosomes on a des bras courtes et longues qui sont diff. (= gènes différentes). Donc on va avoir une région subtélomèrique dans la partie terminale du chromosome 2 (en haut) qui va être diff. de celle dans la partie du bras longue —> le chromosome 2 va avoir 2 régions subtélomèriques diff. On a 22 paires d’autosome —> 22 x 2 = 44, mais non. On doit pas oublier qu’on a les chromosomes arcocentriques (ils ont des bras longs, avec des régions subtélomèriques spécifiques, mais les bras courtes ne contiennent pas de gènes spécifiques, donc eux ne vont pas avoir des régions subtélomèriques. Donc pour 13,14,15,21,22 on va avoir que une région subtélomèrique).
On avait donc 44 -5 = 39
Ensuite on à les X et Y: se sont des chromosomes (entre eux) très différentes, mais dans les parties terminales les régions sont communes. Les parties terminale du bras courte de l’X et commune à la partie terminale du bras courte de l’Y (et pareille pour le bras long) on les appelles les région pseudoautosomales, car ça ressemble aux autosomes.
Pour tout le reste de la longueur de l’X et l’Y ce sont des gènes qui sont diff. Sauf dans ces régions subtélomèriques ou c’est les mêmes régions sur l’X et l’Y: région pseudoautosomale en Xp terminale Yp terminale et Xq terminale et Yq terminale
Donc là on a des régions subtélomèriques comme pour les autosomes: 39 + 2 = 41 régions subtélomèriques differentes
Les sondes subtélomériques (n= 41) détectent..
la majorité des anomalies familiales
Étude globale du génome
→ Comparative Genomic Hybridization (CGH)
◼ Entre la cytogénétique et la biologie moléculaire
◼ Résolution supérieure au caryotype
◼ Etude quantitative et non morphologique
La technique CGH micro-array
C’est une technique qui permet de détecter uniquement les...
déséquilibre chromosomique, on va pas voir les chromosomes (on les visualise pas)
On va pas pouvoir mettre en évidence une translocation équilibré p.ex
La technique CGH micro-array est aussi une technique de cytogénétique moléculaire, qui donc permet de..
détecter des anomalies chromosomiques (microdélétion/microduplication), comme pour la FISH, sauf que on va pouvoir tester des milliers de régions chromosomiques en une seule fois. On va avoir la possibilité de détecter des anomalies chromosomiques beaucoup plus petites que ce qui peut être détecter grâce a un caryotype ou une technique de FISH.
Array
sur une lame de verre (1x1cm) on a des déposés, des fragments d’ADN, et c’est miniaturisé, on va avoir des déposes qui sont spécifiques à une région donné et donc énormément de fragments d’ADN déposés
Quel est l'objectif de la technique de CGH array?
Détection de délétions et/ou duplications chromosomiques
Comme pour le carytype et la FISH, l’objectif de cette technique CGH array c’est la détection des anomalies chromosomiques, mais...
des anomalies beaucoup plus petites que celles on peut détecter avec le caryotype ou la FISH. En plus on peut faire une analyse de toute le génome
Principe général de la technique de CGH array
• ADNs génomique d’un patient et d’un sujet contrôle « normal » marqués de 2 fluorochromes différents
• Co-hybridation sur une puce à ADN
L’ADN du patient: on va faire une..
extraction d’ADN, on ne travaille par sur les chromosomes. On fait une prise de sang, on va broiller les cellules, extraire l’ADN et on va le marquer d’une molécule fluorescente (là on rouge pour l’ADN du patient).
Après on dispose d’un autre ADN d’un individu dont on sait qu’il n’a pas d’anomalie chromosomique, donc qui va être normale. On va le marquer d’une molécule fluorescente d’un autre couleur (ici orange).
On va casser ces molécules d’ADN, on va avoir des séquences d’ADN qui vont faire quelque centaines de pb, ce qui va permettre l’hybridation et puis on va mélanger ces 2 ADN (du patient avec celle contrôle) et on va dénaturer de façon que ces ADN se
retrouvent en molécules simple brin qui va permettre l’hybridation des acides nucléiques.
On dépose ça sur une puce à ADN ou les séquences d’ADN sont aussi simple brin. On va avoir l’ADN du patient et l’ADN témoin qui vont...
s’hybrider sur les séquences d’ADN pour lesquelles elles sont spécifiques (sur le puce ADN).
Si on a une région qui est normale, les séquences d’ADN vont..
s’hybrider sur un spot donné pour lesquelles elles sont spécifiques. Vue qu’on à la même quantité d’ADN marqué en vert et en rouge, on aura une fluorescence qui sera autant verte que rouge. Verte + rouge = jaune. On aura donc des spot jaune.
Si on a chez notre patient une délétion chromosomique, p.ex. la région délété, chez notre patient on va avoir, pour cette région là, une..
seule copie de la région marqué en rouge. Donc on aura 2x moins d’ADN de cette région là que chez notre ADN témoin. Donc on aura moins de fluorescence rouge et plus de verte —> on aura des spot plus verte que rouge.
À l’inverse, si chez le patient on a une duplication chromosomique, pour cette région chromosomique là on aura..
3 copies de l’ADN au lieu de 2. Par rapport a notre ADN témoin cette région chromosomique là on aura plus de séquences marqués en rouge qu’on verte. Après hybridation on aura plus de séquence marqué en rouge —> spot rouge
On va mesurer ces fluorescence et on va traduire ça par des valeurs et on va transformer ça informatiquement pour avoir des graphes qui vont placer les ratio de fluorescence verte/orange.
Pour une région normale on aura des ratio de fluorescence qui auront des valeurs..
0 = région normale.
Pour une région chromosomique dupliqué, on aura plus de rouge que de verte = valeurs...
supérieur à 0 = duplication chromosomique
Si on a une délétion chromosomique on va avoir des ratios de fluorescence avec plus de verte que du rouge, les valeurs seront...
négatives
CGH array
voir image
10% des cas/des diagnostiques sont explique par ces..
microremaniement qui peuvent intervenir partout, sur toute le génome, sur n’importe quel chromosome.
quelles sont les limites techniques du caryotype?
que dans 90% des cas on ne voit pas les anomalies!
Quand on a un enfant avec une déficience intellectuelle et qu’on lui fait un caryotype, on trouve une anomalie chromosomique qui va être visible au caryotype dans environ 10% des cas.
avec la cytogénétique classique on voit les bande chromosomique de quelle grandeur?
10 Mb (Dans 10 Mb on va avoir pas male de gène, souvent plusieurs dizaines de gènes)
Le caryotype classique permet de détécter des anomalies chromosiques (le cris du chat, la délétion 5p terminale sont déjà très difficile a voir dans un caryotype classique) quand il manque une bande chromosomique ou tout un chromosome. La taille d’une bande chromosomique en pb une dizaine de million de nucléotides de base d’ADN ou simplement pb = une dizaine de megabase (Mb). Plus petit que ça on va pas le voir dans le caryotype
Quand on parle de cytogénétique moléculaire ça concerne des maladies génétiques qui restent des anomalies chromosomiques mais qui vont être des maladies chromosomiques qui vont être d’une taille...
plus petites de ce qu’on peut détécter avec un caryotype classique.
On a les maladies moléculaires qui concernent souvent des maladies..
monogéniques —> là on va avoir une base qui va être anormale. Ces técniques sont basé sur la PCR mais pas seulement
la cytogénétique moléculaire se base sur 2 types d'étude:
Étude ciblée du génome
hybridation in situ en fluorescence (FISH)
Étude globale du génome
comparative genomic hybridization (CGH) array
sur quelle principe se base la cytogénétique moléculaire?
sur la capacité de l’ADN à se dénaturer et se renaturer --> hybridation
Comment fonction la technique FISH?
- besoin d'une sonde
- séquence d'oligonucléotides capable de reconnaître une séquence du génome
- marquer la sonde: fluorescence
quelle est la démarche de FISH?
On fait une prise de sang, on fait une culture —> on va avoir des noyaux en métaphases, après on va dénaturer —> toutes est en simple brin, on va mettre la sonde et on remet a 37 dégrés
La sonde va pouvoir s’hybrider à un endroit spécifique ou elle est complémentaire
Principe de l’hybridation in situ en fluorescence (FISH)
Si tout est normale, on aura 2 spots rouge, si par contre on a une déletion sur un des deux chromatides soeurs on aura qu’un seul spot
sur quels noyaux on peut faire la technique de FISH?
◼ Noyaux en métaphase
◼ Classiquement après culture de lymphocytes
◼ Mais aussi sur prélèvement de moelle ou sur culture de fibroblastes
◼ Possiblement sur tout tissu qui prolifère
Sur noyaux en métaphases ont va étudier...
des syndromes microdélétionnels/microduplicationnels
des régions subtélomèrique
Etude des syndromes microdélétionnels/microduplicationnels
◼ Microdélétion/duplication: remaniement chromosomique de petite taille (infracytogénétique)
◼Spécifique d’un syndrome cliniquement identifiable
◼ Environ 40 syndromes microdélétionnels/duplicationnels
◼ Représentent 1/1000 naissances
Principaux syndromes microdélétionnels
- microdélétion 22q11.2
- syndromes de Prader-Willi/Angelman
Microdélétion 22q11.2
L’incidence de cette délétion estimée de..
1/4'000
Microdélétion 22q11.2
Extrème variabilité d’expression..
inter et intra-familiale
quels sont les signes de la microdélétion 22q11.2 ?
◼ Dysmorphie crâniofaciale
◼ Malformation cardiaque
◼ Fente palatine ou insuffisance vélaire
◼ Hypoplasie du thymus (troubles immunitaires)
◼ Troubles de l’apprentissage
Microdélétion 22q11.2
◼ Syndrome de DiGeorge
◼ Dysmorphie craniofaciale
- visage rond
- racine du nez large (est assez évocateur de cette microdélétion)
- fentes palpébrales étroites
Confirmation du diagnostic
-quel est le gène majeur muté dans la microdélétion 22q11.2 ?
TBX1
comment on procède pour la confirmation du diagnoctic?
◼ Caryotype + FISH
◼ 94% de délétions de novo
◼ 6% de délétions héritées
◼ Examen des parents +++
quelle est le risque de récurrence?
50% si parent atteint et <1% si de novo
-
- 1 / 42
-
Lernkarten
CGH array
voir image
10% des cas/des diagnostiques sont explique par ces..
microremaniement qui peuvent intervenir partout, sur toute le génome, sur n’importe quel chromosome.
