Molekularbiologie
4.Semester
4.Semester
Die Vektorstrukturen von pPIC9?
- 5'-AOX1
- Signal sequence
- MCS
- 3'- AOX1 (TT)
- HIS4
- 3'-AOX1
- pBR322
- AmpicillinR
- nicht vorhanden, da Integration
- KanR bei pPIC9K
- 5'-AOX1 Promotor --> Induktion Methanol
- Signal sequence --> Sekretion
- MCS --> Ligation (RT)-PCR Produkt
- 3'- AOX1 (TT) --> Terminator Poly-A Signal
- HIS4 --> Auxotrophie marker
- 3'-AOX1 --> Herstellung Muts Stamm
- pBR322 --> E.coli Selektion
- AmpicillinR --> E.coil Selektion
- nicht vorhanden, da Integration --> ori von E.coli, Pichia hat kein E.coli
- KanR bei pPIC9K --> Resistenzgen
Bei welchem Mut ist die mehrfache Integration nicht möglich?
bei MutS
Was bedeuten diese Begriffe?
- Mut
- MutS
- HIS4
- AOX1
- ARG4
- Mut: Methanol utilization
- MutS: Methanol utilization slow
- HIS4: Histidinol-Dehydrogenase
- AOX1: Alkohol-Oxidase 1
- ARG4: Argininosuccinate-Lyase: (Arginin-Synthese)
Wie stellt man den Mut+ HIS Stamm her?
In die GS115: pPIC9 --> Integration in das his4 Gen
Wie wird MutS, His hergestellt?
GS115: pPIC9--> Integration von AOX1 Gen
Wie sieht das integrierte MUT+ Plasmid aus?
Genotyp Mut+, erzähle die wichtigsten Punkte (4)
- Integration pPIC9 über HIS4 ins Genom
- mehrfache Integration möglich: höhere rekombinante Proteinausbeute
- AOX1-Gen auf dem Chromosom intakt
- Induktion von 5' AOX1 mit Methanol
MutS zähle die wichtigsten 4 punke auf:
- sehr geringe Verwertung von Methanol (AOX2)
- Glycerin als C-Quelle • Integration pPIC9 über AOX1 ins Genom
- AOX1-Gen auf dem Chromosom nicht intakt: ΔAOX1
- Induktion von 5' AOX1 mit Methanol
- pPIC9 mit BglII geschnitten: AmpR und ori von E. coli werden entfernt!
Was machen die Agrobakterien in der Natur?
Agrobakterien können bestimmte Pflanzen, vor allem zweikeimblättrige (Dikotyle) wie z.B. Kartoffeln, Tomaten, Tabak infizieren. Dadurch werden krebsartige Wucherungen im Wurzelhalsbereich hervorgerufen.
Dabei integrieren sie eine Passage ihrer T-DNA in die nukleäre DNA der Pflanze.
Was bildet die Pflanze, wenn sie verletzt wird?
Acetosyringon: AS
Grösse Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens?
215 kb
Wie sieht das Ti-Plasmid (Tumorinduzierend) vom Nopalin Typ aus?
Wie muss der pH sein, damit tDNA übertragen wird? und welches Medium? und was muss man eventuell zusetzen?
tiefer pH bei 5.5, Glukose hinzugeben und manchmal muss man Acetosyrington zugeben.
Wie funktioniert die Phosphorylierung von VirG durch VirA?
- Wenn Pflanze verletzt--> Acetosyringon (AS) wird ausgeschüttet.
- AS lockt die Viren an
- Das Ti-Plasmid hat einige Gene.. (siehe Bild) von linke DNA Grenze bis rechte DNA Grenze
- Agrobakterien hat Vir A Rezeptor, der Ligand der dazu passt ist der Acetosyringon
- AS dockt an VirA Rezeptor und aktiviert/phosphoryliert. und VirG wird phosphoriliert
- VirG, das phosphoriliert wurde, bindet an Virulenzgene und arbeitet als Transkriptionsfaktor
- DNA Polymerase fängt an --> mRNA
- Proteine die gebildet werden; VirD1 und 2 (die li und re DNA schneiden), VirE lagernt sich um die gschnittene DNA (Schutzhülle)
- VirD2--> besitzt am C Terminus nuclear localization signals für Pflanzen
- Achtung es wird nur ein Einzelstrang geschnitten!
- Durch einen Pilus wird die tDNA übertragen und geht zum Pflanzen DNA Strang, der komplemente Strang wird noch gebildet.
- In Pflanze Die Auxine und Cytokiningene (Hormone) werden abgelesen und es bilden sich neue Zellen (Tumor).
Wofür braucht man den GUS Vektor?
um die räumliche und zeitliche Genexpression sichbar zu machen und sicherzustellen. Der GUS Vektor verleiht der Pflanze die Farbe
Wie sieht der pGUS Vektor aus?
Was macht der Partikelgun?
T-DNA ist auf den Goldpartikel drin und man schiesst in die Pflanzenpartikel rein.
.Ti-Plasmid ---> zum GUS Vektor?
Welche 3 Aktivitäten hat die DNA Polymerase?
- 5'-3' Exonuclease (Replikation, RNA durch DNA ersetzen)
- 3'-5' Exonuclease (proof reading)
- Polymerase (ss DNA als template)
Was wird als Klenow Fragment bezeichnet?
3'-5' Exonuclease
und Polymerase
Was ist ein Promotor?
Erkennungsstelle/Bindungsstelle für die RNA Polymerase. Der Promotor ist eine Stelle auf der DNA, der vor einem Genanfang liegt.
Genaufbau der Bakterien:
Auf welcher Untereinheit ist das aktive Zentrum?
beta Untereinheit
Was macht die DNA Ligase?
verknüpft die DNA Stränge
von wo bis wo ist Upstream beim DNA Strang?
-35,-10 Region bis mitte RBS
Wie ist die DNA geladen und zu welchen Pol wandert die DNA?
negativ geladen, wegen Phosphate und wandert deshalb zum positiven Pol
Was ist ori?
Origin of replication
Sequenz der -35 Box?
TTGACA
Sequenz der -10 Box?
TATAAT
Was bedeutet es wenn eine Haarnadelschleife entsteht?
Terminator
Wo ist die Alkohol-Dehydrogenase zu finden? und was macht sie?
im Periplasma!
Oxidation von Ethanol zu Acetaldehyd.
ein Stoppcodon
TAA
Was ist ein Rho-Protein? was macht die?
Termination.
- Rho-Protein besitzt 6 identische Untereinheiten.
- 5'-3'
- trennt die RNA-DNA-Hybrid wodurch RNA freigesetzt wird. unter ATPase-Aktivität.
- Inverted repeats
Wo sind die Proteine mit Disulfidbrücken enthalten?
nur im Periplasma, weil dort die Oxidationsbedingungen vorhanden sind. Im Zytoplasma nicht!
Terminal ?--> Signalsequenz bei Menschen
Terminal ? --> Signalsequenz Hefe
Mensch --> C-Terminal
Hefe--> N Terminal
Wie muss das Gen aufgebaut sein, damit das Protein im Cytosol bleibt?
Promotor, mcs1,nucA,mcs2 --> KEIN SIGNALPEPTID!
Wie muss das Gen aufgebaut sein, damit das Protein sekretiert wird?
Promotor, RBS, SIGNALPEPTID, mcs1,nucA,mcs2,
Wie muss das Gen aufgebaut sein, damit das Protein an Zellwand verankert wird?
muss cwa beinhalten und signalpeptid.
Was ist eine Sortase?
Aufgabe: die sezernierte Proteien in der Peptidoglycanschicht zu verankern, LPSTG erkennt die Sortase. kann man mit Nuklease-plate-assay zeigen.
Auf was wirkt das Fosfomycin?
MurA und MurB
-
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Flashcards
Was bedeutet methylotroph?
Wachstum auf Methanol
Was sind die AOX1 und AOX2?
Alkohol Oxidasen
Zu was wird Methanol bei Pichia durch AOX1 und AOX2 umgewandetl? Welches Gen ist stärker vertreten?
zu Formaldehyd. AOX1 ist stärker 90%, AOX2 nur 10% aktiv
Wie kann das Wachstum von Pichia mit dem AOX1 Promotor unterdrückt werden?
Zugabe Glukose
Bedeutung Auxotrophie?
auf Wuchsstoffe angewiesen
Wie sieht pPIC9 aus?
Die Vektorstrukturen von pPIC9?
- 5'-AOX1
- Signal sequence
- MCS
- 3'- AOX1 (TT)
- HIS4
- 3'-AOX1
- pBR322
- AmpicillinR
- nicht vorhanden, da Integration
- KanR bei pPIC9K
- 5'-AOX1 Promotor --> Induktion Methanol
- Signal sequence --> Sekretion
- MCS --> Ligation (RT)-PCR Produkt
- 3'- AOX1 (TT) --> Terminator Poly-A Signal
- HIS4 --> Auxotrophie marker
- 3'-AOX1 --> Herstellung Muts Stamm
- pBR322 --> E.coli Selektion
- AmpicillinR --> E.coil Selektion
- nicht vorhanden, da Integration --> ori von E.coli, Pichia hat kein E.coli
- KanR bei pPIC9K --> Resistenzgen
Bei welchem Mut ist die mehrfache Integration nicht möglich?
bei MutS
Was bedeuten diese Begriffe?
- Mut
- MutS
- HIS4
- AOX1
- ARG4
- Mut: Methanol utilization
- MutS: Methanol utilization slow
- HIS4: Histidinol-Dehydrogenase
- AOX1: Alkohol-Oxidase 1
- ARG4: Argininosuccinate-Lyase: (Arginin-Synthese)
Wie stellt man den Mut+ HIS Stamm her?
In die GS115: pPIC9 --> Integration in das his4 Gen
Wie wird MutS, His hergestellt?
GS115: pPIC9--> Integration von AOX1 Gen
Wie sieht das integrierte MUT+ Plasmid aus?
Genotyp Mut+, erzähle die wichtigsten Punkte (4)
- Integration pPIC9 über HIS4 ins Genom
- mehrfache Integration möglich: höhere rekombinante Proteinausbeute
- AOX1-Gen auf dem Chromosom intakt
- Induktion von 5' AOX1 mit Methanol
MutS zähle die wichtigsten 4 punke auf:
- sehr geringe Verwertung von Methanol (AOX2)
- Glycerin als C-Quelle • Integration pPIC9 über AOX1 ins Genom
- AOX1-Gen auf dem Chromosom nicht intakt: ΔAOX1
- Induktion von 5' AOX1 mit Methanol
- pPIC9 mit BglII geschnitten: AmpR und ori von E. coli werden entfernt!
Was machen die Agrobakterien in der Natur?
Agrobakterien können bestimmte Pflanzen, vor allem zweikeimblättrige (Dikotyle) wie z.B. Kartoffeln, Tomaten, Tabak infizieren. Dadurch werden krebsartige Wucherungen im Wurzelhalsbereich hervorgerufen.
Dabei integrieren sie eine Passage ihrer T-DNA in die nukleäre DNA der Pflanze.
Was bildet die Pflanze, wenn sie verletzt wird?
Acetosyringon: AS
Grösse Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens?
215 kb
Wie sieht das Ti-Plasmid (Tumorinduzierend) vom Nopalin Typ aus?
Wie muss der pH sein, damit tDNA übertragen wird? und welches Medium? und was muss man eventuell zusetzen?
tiefer pH bei 5.5, Glukose hinzugeben und manchmal muss man Acetosyrington zugeben.
Wie funktioniert die Phosphorylierung von VirG durch VirA?
- Wenn Pflanze verletzt--> Acetosyringon (AS) wird ausgeschüttet.
- AS lockt die Viren an
- Das Ti-Plasmid hat einige Gene.. (siehe Bild) von linke DNA Grenze bis rechte DNA Grenze
- Agrobakterien hat Vir A Rezeptor, der Ligand der dazu passt ist der Acetosyringon
- AS dockt an VirA Rezeptor und aktiviert/phosphoryliert. und VirG wird phosphoriliert
- VirG, das phosphoriliert wurde, bindet an Virulenzgene und arbeitet als Transkriptionsfaktor
- DNA Polymerase fängt an --> mRNA
- Proteine die gebildet werden; VirD1 und 2 (die li und re DNA schneiden), VirE lagernt sich um die gschnittene DNA (Schutzhülle)
- VirD2--> besitzt am C Terminus nuclear localization signals für Pflanzen
- Achtung es wird nur ein Einzelstrang geschnitten!
- Durch einen Pilus wird die tDNA übertragen und geht zum Pflanzen DNA Strang, der komplemente Strang wird noch gebildet.
- In Pflanze Die Auxine und Cytokiningene (Hormone) werden abgelesen und es bilden sich neue Zellen (Tumor).
Wofür braucht man den GUS Vektor?
um die räumliche und zeitliche Genexpression sichbar zu machen und sicherzustellen. Der GUS Vektor verleiht der Pflanze die Farbe
Wie sieht der pGUS Vektor aus?
Was macht der Partikelgun?
T-DNA ist auf den Goldpartikel drin und man schiesst in die Pflanzenpartikel rein.
.Ti-Plasmid ---> zum GUS Vektor?
Welche 3 Aktivitäten hat die DNA Polymerase?
- 5'-3' Exonuclease (Replikation, RNA durch DNA ersetzen)
- 3'-5' Exonuclease (proof reading)
- Polymerase (ss DNA als template)
Was wird als Klenow Fragment bezeichnet?
3'-5' Exonuclease
und Polymerase
