Allg. Labortechnick

1.) Beschichten: Ak/Ag werden in Coating-Puffer in Kavitäten gefüllt. Adsorption (Anlagerung) der Immunkomponenten ans Polystyrol (VdW-Kräfte)

2.) Blockieren: Blockierer auftragen, der noch freie Bindungsstellen der ELISA-Kavitäten sättigt. (Verhinderung der Bindung von Probenbestandteilen an Platte= falsche/unspezifische Signale)

3.) Stabilisierung: Auftragung des Liquid Plate Sealer. Verlängert Haltbarkeit und gewährt Funktionstüchtigkeit der Komponenten.

Der Marker ist das Enzym, welches die Reaktion zur Detektion des Analyten katalisiert.

Fluorsezierend oder farbiges Produkt

V.a AP und Meerrettich-Peroxidas (HRP)

V.a. zum Nachweis von Haptenen. Hapten zu klein um gleichzeitig 2 AK zu binden, Sandwich ungeeignet. Hapten braucht Carrier (Protein, welches nach der Kopplung die Bildung von Ak induzieren kann)

Messsignal immer umgekehrt Proportional.

Damit ein genügend starkes Messsignal bei geringer Analytenkonzentration auftritt (Nachweis von geringen Mengen möglich, höhere Sensitivität). 

Strept-Avidin-Biotin-System 

Avidin aus Hühnereiweiss, Strept-Avidin aus Pilz. Beide hohe Affinität zu Biotin (Vitamin B7)

1.) Kopplung 5-10 Biotin an einen Antikörper

2.) Enzymmarkiertes (Strept-) Avidin dazugeben, Bindung/Kopplung an Biotin.

3.) 1 Ak= 5-10 Enzyme = 5-10 mehr Substratumsetzung. Schneller und stärkere Messreaktion, erhöht Sensitivität.

Einzeltest-Prinzip, d.h. nur so viel Reagenz, wie tatsächlich benötigt wird (1 Patient - 1 Reagenzriegel - 1 Festphasenrezeptor - 1 Ergebniss)

1.) Festphasenrezeptors (SPR-Spritze/Pipette): mit Ag/Ak beschichtet.

2.) Reagenzienriegel: enthält alle notwendigen Reagenzien.

1.) Immunologische Reaktion

2.) Enzymreaktion

Gegensatz zu ELISA wird keine optische Farbreaktion erzeugt/provoziert.

- Substrat (4-Methyl-umbelliferyl-phosphat) mithilfe ALP/AP in ein fluoreszierendes Produkt umwandeln. Messung bei 450nm

Vorgänger (RIA=1960, ELISA=1970)

- sehr hohe Nachweisempfindlichkeit. Durch Verwendung vom radioaktiven Isotop Jod125 ist Nachweisgrenze bis zu 10^6 niedriger, d.h Kontentration im Pico-Femtogramm (1fG=1^-15 Gramm) quantitativ bestimmbar.

- basiert auf Kompetitivem Bindungsprinzip, 

- Tracer=reagenzenthaltene radioaktive-markierte Ak/Ag

- Umgekehrt proportional Messsignal

- meistens qualitativer Test (nachweisbar/ nicht nachweisbar) 

- Entscheidend Cut-Off Point

- Schnelltests meistens teuer und müssen quantitativ Bestätigt werden

1.) In Probe enthaltene Ag/Ak bilden im Auftragungsfeld spezifische Ag-Ak-Komplexe (farbmarkiert).

2.) Komplexe durchfliessen Membran und werden an der Testlinie durch immobilisierte Ak/Ag gebunden.

3.) Korrekter Ablauf, Kontrollinie ersichtlich. 

4.) Überschüssige Flüssigkeit wird vom Filterkissen aufgenommen (verhindert Rückfluss der Probe)

1.) Analyt bindet im Auftragsfeld an Farbmarkierte Antikörper gegen den Analyten. (falls vorhanden)

2.) Beim durchliessen der Probe (mit Anti-Analyt-Ak) binden diese an ein, an der Testlinie immobilisiertes Analytenkonjugat. (Analyt vorhanden=Ak-gesättigt, kein Analyt vorhanden= bindung an Konjugat)

3.) Kontrollinie für korrekte Testdurchführung

2 Linien erkennbar

Nur 1 Linie erkennbar (nur Kontrolllinie)

Definition: falsch niedrige/falsch negative Bestimmung bei sehr hoher Analytenkonzentration.

Heidelberg-Kendal-Kurve

1.) Antikörperüberschuss verhindert Präzipitation.

- Alle Ak komplett gesättigt= keine Komplexe

- Keine Ak gesättigt/kein Analyt= keine Komplexe

- wenig-viele Ak gesättigt= Ag-Ak-Komplexe= Trübung

- ELFA

- Hämagglutinationstest/ Latex-Agglutinationstes

- Chromatographische Immunoassay (nur Sandwich)

- Probe verdünnt und unverdünnt analysieren lassen.

- Auf andere Test ausweichen (ELISA, kompetitiver Schnelltest)

Enzym Linked Immunosorbent Assay

Enzymgekoppleter Immunkomponenten Anreicherungstest

Radioimmunoassay

Enzym Linked Fluorescent Assay

Proteine

Hormone

Tumormarker

Drogen/Medikamente

Infektionserreger

Liquor, Urin, Stuhl, Speichel, Vollblut, Serum, Plasma

Immunglobuline gegen das gleiche Antigen, jedoch gegen unterschiedliche Epitope.

Preisgünstig

Schnell/unkomplizierte Herstellung

viele Epitope eines Antigens werden erfasst= hohe sensitivität 

Neigen zur Kreuzreaktivität

Alle aus einem B-Lymphozyten, binden/erkennen nur ein Epitop eines Antigens.

1.) Injektion eines Antigens in eine Maus

2.) Entnahme von Plasmazellen (B-Lymphozyten)

3.) Fusion Plasmazelle mit Myelomzelle (Hybridisierung)

4.) Entstandene Hybridomazelle kultivieren auf HAT (Nähr-/Selektionsmedium, überleben nur fusionierte Hybridomazellen, keine Plasma oder Myelomzellen)

5.) Isolieren der Zelllinien und auswahl der passenden Ak produzierenden Zellen.

6.) Kultivierung und entnahme der monoklonalen AK.

Grosse Mengen herstellbar

Qualität bleibt gleich

theoretisch unendlich methodisch Reproduzierbar

sehr spezifisch

fastkeine Kreuzreaktivität

Erst-Herstellung ist zeit-/Kostenaufwändig

weniger Sensitiv (v.a. bei Analyten mit wenigen Epitopen)

Wieviele Gesunde als Gesunde (Nicht-krank) erkannt werden, Falsch-Positiv-Rate.

Wieviele Kranke als Krank erfasst wurden, Falsch-Negativ-Rate.

Konkurrenz zwischen markierten und unmarkierten Antikörpern/Antigenen um eine Bindungsstelle.

Gesuchter Analyt wird zwischen einem (i.d.R immobilisierten) Fänger und einem Detektionsantikörper eingelagert.

Ausfallende, neu entstandene Ag-Ak-Komplexe, die durch die Reaktion nicht mehr löslich sind und zu einer Trübung des Reagenz führen.

Messung des, durch Ag-Ak-Komplexen gestreuuten, seitlichen Lichts. 

direkt Proportional zur Konzentration.

Messung der Intensitätsminderung des axialen Lichts.

umgekehrt Proportional