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Cartes-fiches
Primärkultur von Endothelzellen (Heterogenes Spendergewebe)
- Arterie freipräparieren
- Desinfektion mit Antibiotika
- Arterie öffnen und Oberfläche schaben
- Abgelöste Zellen waschen, eine Woche kultivieren
- Endothelzellen durch selektives Abschaben/trypsinieren isolieren, dann in Kultur bringen
- Kultur testen: angiotensin converting enzyme
Lasermikrodissektion
=> Wenn die Zellen nicht in mehreren Schichten aneinander gelagert sind, sondern wenn diese Gewebschichten größer, aber trotzdem inhomogen sind.
Dabei will man z.B. die mittlere Zellpopulation isolieren. Dafür verwendet man Lasermikrodissektion. Dazu braucht man ein Mikroskop mit Zusatzausstattung von Lasermikrodissektion.
- Präparat wird auf Mikroskoptisch gelegt.
- Unter Mikroskop kann man das Bereich markieren, die man ausschneiden/isolieren lassen will.
- Danach schneidet der Laser entlang der vorgezeichneten Linie das Gewebe aus (sehr genau).
- Dann wird dieses ausgeschnittene Präparat mit einem kurzen Laserpuls hochkatapultiert/rausgeschossen und mit einer Eppendorf-Tube aufgefangen (berührungslose Transport in das Auffanggefäß => Mikrodissektat hebt sich vom Träger ab und fliegt ins Cap).
- Danach wird dieses Gewebe in Kultur gebracht.
Typische Probleme der Primärkultur
- Standardprotokolle sind meist supoptimal -> Optimierung der Medien durch Supplemente, Zellspezifika beachten.
- Geringe Vitalitätsrate
- geschädigten Zellen vor dem Aussaat mittels Zentrifugation zu entfernen, so dass sie das Wachstum der vitalen Zellen nicht beeinträchtigen
- hohe Aussaatdichte, da viele Zellen im Laufe der Dissoziation geschädigt werden.
- Zellen bleiben in Suspension, obwohl sie adhärent wachsende Zellen sind -
- Substratoberfläche behandeln z.B. RGD-Motiv, die mit der Integrine der Zellen integrieren.
- Feeder Layer: Zellen, die wachstumsarretiert sind und die Substratoberfläche bedecken. Diese Zellen liefern Zellkontakte für die Primärkultur und mitogene Substanzen
- Falsche Zellen gehen an (Selektionseffekte)
- Medium, Substratoberfläche, Inkubationsbedingungen optimieren.
- Kontamination (vorzeitige Trübung des Mediums)
- Antibiotika, insb. Hautbiopsien
Organkultur
- Partielle oder komplette entnahme von Organen zur kurzzeitigen Kultur in vitro
- Problematisch: Bewahrung der Vitalität im Organverband, organspezifische Funktion, Differenzierung
- Maßnahmen: speziesspezifische unterschiede berücksichtigen, Temperaturabsenkung, Optimierung der Perfusionslösung, Sauerstoffdruck
- Modell für kurzzeitexperiment: Integrität der Zellen und Einhaltung der Versuchsbedingungen prüfen
Perfusionskultur von Leberschnitten
toxikologische screening
- Leber freipräpatieren
- Leberlappen stanzen
- Mikrotomdünnschnitte
- Präparat in Medium aufnehmen
- In Perfusionssystem transferieren
Klonierung
= Zellpopulation aus eine Einzelzelle züchten
Klonierung zur Isolierung von Zielzellen einer Subpopulation (zB nach Primärkultur), bei Veränderung existierender Zelllinien, bei Kontaminationen
- Klon nicht unbedingt homogen (änderungen durch zB spontane Mutation, Dedifferenzierung, epigenetische Faktoren)
- einsatz von Wachstumsfaktoren, konditionierte Medien, Feeder Zellen
- Klonierung in log. Wachstumsphase
- Zellen reklonieren
- Analyse der Zellen
- Sicherheitskopien einzelner Klonierungsstadien
Standard-Klonierungsmethoden
ZIel: Wachstum eines Klons pro Kavität
- Limited dilution: Aus der Kultur die man klonieren will nimmt man 100 Zellen, verdünnt die in einem Medium und aliquotiert dieses Mediumvolumen in Hundertsteln auf die verschiedene Kavitäten -> statistisch in jeder Kavität gibt’s eine Zelle. Man gibt die Zellen in die Inkubator und lässt sie wachsen. Dann wird mikroskopiert. Problem: Stimulation von Umgebung fehlt (-> Proliferationssignale von der Umgebung fehlen)
- Klonierung in Weichagar: Zellsuspension mit Weichagar mischen, in Kulturgefäß geben, nach einigen Tagen die gewachsene Klone in Eizelkavitäten übertragen mit einer Pasteurpipette oder Mikromanipulator
- Einzelzellabgabe: Serielle Zellverdünnung, Ablage flacher Tropfen, Zellzahl protokolieren, Medium zugeben,
Gefahr und Maßnahmen bei Klonierung
Gefahr bei Klonierung: Unzureichende Signale aus der Umgebung auf die Zellen
Maßnahmen:
- Medienoptimierung
- Mehr fetales Kälberserum mit Signalstoffen zugeben
-Substratbehandlung mit Anheftungsfaktoren
- Variation der Zelldichten (unterschiedliche Menge an Zellen in Kavitäten)
- Wachstumsstimulation mit Feederzelle, koditionierte Mediien & Cytokine
- Feeder Zellen: Liefern ECM, Wachstumssignale, Rezeptoren
- Konditionierte Medien: Medien wo Zellen schon kultiviert wurden, stimulierende WF wurden von diese Zellen abgegeben, aber Medium ist noch nicht verbraucht
- Cytokine: Änderung des Proliferationsstatus oder Differenzierungsstadium
Klonierung adhärenter Zellen
Trypsinierung der Zellen und die Klonierung findet analog wie bei Suspensionskultur
- Klonierungszylinder: Klonierungsring über Zielzelle positionieren, MEdium entfernen, trypsinieren, Zelle abnehmen
- Cellulose Filter: Dabei wird anstelle eines Zylinders eine mit Trypsin-getränktes Filterplättchen benutzt. Nachdem das Medium abgenommen wurde, wird diese Filterplättchen auf Zielzellkultur gelegt und Trypsin sorgt dafür, dass die Zellen sich von Substrat ablösen.
Finite Zelllinien
Zelllinien von begrenzter Lebensdauer
- Begrenzter Anzahl von Zellteilungen
- Behält diploiden Karyotyp der Ursprungsgewebes bei
- Zellen die weiter Proliferieren = Transformierte Zellen, benutzt man zur Herstellung von Permanentlinien
Permanentlinien
Zelllinie mit unbegrenzter Lebensdauer
- Unbegrenzter Anzahl von Zellteilungen
- aneuploider Chromosomensatz. Chromosomensatz weit gespannt
- kürzere Generationszeiten 12-24 h (Proliferieren schnell)
- einfachere Kulturmedien (serumfrei)
- häufig Substratunabhängig (suspensionskultur möglich)
- verlust der Kontaktinhibition (Dichtelimitierung) -> Mehrschichtiges Wachstum
- überexpression von Onkogenen
- Oft Verlust der Differenzierung
Transformation
spontane oder induzierte permanente phänotypische Änderung der Zellen durch vererbbare Änderung der DNA und Genexpression hervorgerufen
Eigenschaften:
- Genetische Instabilität: Chromosomenanomalien, Variation der DNA Menge
- Immortalität: Inaktivierung dominanter Seneszenzgene die als negative Regulatoren im Zellzyklus sorgen, durch Mutation der Seneszenzgene oder Überkompensation durch Onkogene (Verursachen Eintritt ins Zellzyklus)
- Wachstumsanomalien: Verlust der Zell-Zell bzw. Zell-Substratadhäsion und Kontaktinhibition, reduzierte serumabhängigkeit, Überexpression von Onkogenen
- Malignität: Bildung invasiver Tumore nach Implantation in genetisch identische Wirtsorganismus oder Transplantation als Xenograft in immundefiziente Maus, Invasivität => diese invasive Zellen sind in der Lage, die Umgebung so zu stimulieren, dass neue Blutgefäße gebildet werden (Angiogenese)
Übergang einer Zelle von begrenzter zu unbegrenzer Lebensdauer
Spontan: häufig bei Nagern, selten bei humanen Zellen
Aktive Immortalisierung durch: (Zelle wird auf der Genebene manipuliert, so dass mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit Mutationen auftreten, die dazu führen, dass Seneszenzgene inaktiviert oder Onkogengene aktiviert werden)
- carzinogene Chemikalien
- Bestrahlung (UV, Gamma)
- Infektiom mit RNA/DNA-Viren, z.B. EBV
- virale Onkogene, z.B. große T-Antigen aus SV40
- rekombinante Telomerase
- siRNA: knock out
- Onkogene
- Fusion mit Krebszelllinie, z.B. Hybridomtechnik bei der Produktion der monoklonaler Antikörper
- transgene Maus
Zelluläres Differenzierungspotential
- Totipotent/Omnipotent:= Differenzierung zu allen Zellen des Embryos und extra-embryonale Gewebe/Zellen, z.B. Zygote bis 8-Zellstadium (Morula)
- Pluripotent:= Differenzierung zu Zellen aller 3 Keimblätter (Körperzellen), z.B. Blastozyte
- Multipotent:= können nur Zellen eines Keimblatts generieren (Organersatz) z.B. adulte Stammzellen
- Oligopotent:= z.B. Vorläuferzellen, die sich in 2 Zelltypen differenzieren können
- Unipotent:= die meisten ausdifferenzierten, somatischen Zelle. Wenn diese sich teilen, entstehen 2 Zellen des gleichen Zelltyps
Zellteilung von Stammzellen
- Symmetrische Teilung: Entstehen 2 identische Stammzellen (Selbsterneuerung)
- Asymmetrische Teilung: Ensteht eine Stammzelle und die zweite Zelle ist weiter differenziert (keine Stammzelle, mit niedrigeren Differenzierungspotential).
Ursachen der assymetrischen Teilung:
- Ungleiche Verteilung der Differenzierungsfaktoren
- Zelle wird nicht mittig geteilt, sondern asymmetrisch
=> bestimmte zelluläre Komponente stehen in einer der Tochterzellen in geringeren und in der anderen in höheren Maße zur Verfügung.
Endogene oder exogene Stimuli führen auch zur Gewebersatz (durch asymmetrische Teilung), wenn der entsprechende Bedarf da ist.
Embryonale Stammzellen (pluripotent)
Eigenschaften
- aus innerer Zellmasse der Blastocyte
- lebenslang teilungsfähig (Selbsterneuerung)
- pluripotent (können sich zu allen Körperzellen differenzieren)
Induzierte Pluripotente Stammzellen
1. Yamanaka Faktoren: Durch retrovirale Transduktion aus somatischen Zellen
aus somatischen Zellen (Fibroblasten) wurden pluripotente Zellen durch virale Transduktion hergestellt → Substitut für embryonale Stammzellen. Dabei wurden 4 Gene überexprimiert:
- OCT3 und SOX2: Transkriptionsfaktoren, Pluripotenzmarker.
- KLF4 und c-Myc & NANOG und LIN28
iPS-Zelle wird genommen und in Blastocyte injiziert → Embryo entsteht.
Problem: Da Onkogene benutzt werden (KLF4 und c-Myc), hohe Rate an Karzinome.
- Onkogene weglassen → Effizienz der Induktion gering → Ausbeute an pluripotente Zellen gering
- Onkogene können frühzeitig inaktiviert werden.
2. NT-ES Zellen: Durch Kerntransfer, man nimmt den Kern einer somatischen Zelle und bringt ihn in einer entkernte Eizelle. Daraus wird eine Blastocyste generiert. Die innere Zellmasse der Blastocyste sind dann pluripotente Zellen. Organismen werden primär durch diesen Kerntransfer generiert.
3. Zellfusion: Somatische Zelle mit embryonale Stamzelle fusionieren → Hybridzelle
Quellen für pluripotente SZ in vivo
ES-Zellen: Aus der innere Zellmasse der Blastocyste vor der Implantation
Embryonale Keimzellen: Aus primordialen Keimzellen während der mittleren Schwangerschaft
Keimbahn abgeleitete pluripotente SZ: Aus spermatogonialen SZ von neonatalen und adulten Hoden
Testen ob Gruppe von Zellen ESZ enthält
- Morpholoige
- Bildung von cobblestone artigen Zellen
- Dicht gepackte Kolonien mit klare Grenzen
- Pluripotenzmarker
- Hohe Niveaus an pluripotente Proteine
- Alkalines Phosphatassay
- Keine Marker von differenzierten Zellen
- Differenzierungspotential
- In vivo Teratomaassay
- In vitro Embrioic bodies assay
- Epigenetisches Profil
- Demethylierung von wichtige pluripotente Gene
- Methylierung von spezifische Gene des somatischen Zelltyps
- Karyotypisierung (Suchen nach genetischen Aberrationen)
- Downregulierung von Transgene nach Reprogrammierung
Differenzierungpotential testen
in vivo: Teratoma Assay
Ausbildung von Teratoma (Benigne Keimzelltumor, der sich in alle 3 Keimblätter diffrenzieren kann):
In immunsupprimierete Mäuse (SCID-Mäuse) werden pluripotente SZ injiziert. Entsteht ein Tumor der aus Zellen aller Keimblätter besteht => Mesoderm, Endoderm, Ectoderm.
in vitro: Embryoid bodies assay
Pluripotente Stammzellen in dichten Suspensionkultur gebracht, damit sich Kontakte zwischen den Zellen ausbilden. Das induziert Differenzierung in alle 3 Keimblätter. Bewegung ist ein Indiz dafür, dass sich Herzmuskelzellen gebildet haben.
Anwendungen humaner SZ
Transplantationstherapie, Krankheitsmodelle, Medikamentenentwicklung, Toxintestung, Gentherapie, Organoids
- Endoderm: Lungenerkrankung, Diabetes
- Mesoderm: Kardiologische Erkrankungen
- Ektoderm: Gehirnerkrankung, Augenerkrankung, Hauterkrankung
- Blutstrom: Immunerkrankung
Adulte SZ
Eigenschaften:
- nicht-differenzierte Zellen in differenziertem Gewebe
- lebenslang teilungsfähig (Selbsterneuerung)
- differenziert zu Zelltypen des umgebenden Gewebes => multipotent
Beispiele:
- Hämatopoetische SZ aus Knochenmark (HSZ): Differenzieren in Myeloide und Lymphoide Zellen
- Mesenchymale SZ
- Nervenstammzellen
- Leberstammzellen
Gewinnung Hämatopoetische SZ
Aus peripherem Blut: Die Zellen im Knochenmark werden durch ein Signalstoff (G-CSF) stimuliert → Migration der hämatopoetische Zellen aus dem Knochenmark in das periphere Blut. Durch Blutabnahme kann man diese Zellen gewinnen.
Vorteil ggü HSZ aus KM: keine Narkose nötig, hohe Ausbeute. Besser Überlebensprognosen.
Aus Nabelschnurblut:
Vorteil: Verursachen weniger Abwehrreaktionen, hohe Proliferationskapazität
Kultur muriner Stammzellen
Blastocyst aus Maus isolieren und offen schneiden (Zeitpunkt Diapause). Zellen der inneren Zellmasse mit WF und Fetale Kälberserum FCS auf MEF- Zellen oder LIF kultivieren. Regelmäßig passagieren. Dissoziation individueler, nicht differenzierter kolonien. Klonieren. Identifikation und Selektion nicht differenzierter Zellen
Erhaltung muriner ES im pluripotentem Stadium
- Co-Kultur mit Feeder-Zellen (MEF): Fibroblasten der MEF sorgen dafür, dass keine spontane Differenzierung stattfindet und Pluripotenz beibehalten wird.
- Supplementierung mit LIF
- Wnt-Signalweg, BMP
- Expression des Transkriptionsfaktors Oct-4, Nanog, Sox2 (um die Pluripotenz der Zellen zu untersützen) → Um diese Expressionslevel und Pluripotenz ständig aufrechtzuhalten, kann man die Stamzellen mit ein Plasmid, die diesen Transkriptionsfaktoren exprimiert, transfizieren. Problem: Expressionslevel genau zu kennen und nicht zur Überexpression kommen.
LIF
LIF (Cytokin) bindet an Cyotkinrezeptor und sorgt dafür, dass die STAT3 (Transkriptionsfaktor) aktiviert wird. Die Stimulation der STAT3 führt dazu, dass die Zellen in dieser Selbsterneuerungsmodus bleiben.
Problem: auch andere Proteinkomplexe werden durch Interaktion mit STAT3 aktiviert => SHP2-Interkation (Phosphatase) sorgt dafür, dass die Phosphatreste der STAK3 (Andockmotive) enfernt werden => STAT3-Effekt inhibiert. Damit wird die Selbsterneuerungsmodus reduziert.
Entscheidend ist die Balance der Signaltransduktionswege
Hierbei wirken 2 Kräfte, die ausbalanciert werden müssen. Deswegen behält nur ein Teil der Zellen die pluripotente Status und andere Teil der Zellen werden differenziert.
Wnt Signalweg
Dieser ist normalerweise blockiert durch die GSK-3. Diese inhibiert ß-caterin und blockiert so den Signalweg. Man kann Inhibitoren gegen GSK3 ins Medium zugeben (BIO). Sie sorgt dafür dass Signalweg aktiv wird und die Pluripotenzgene verstärkt exprimiert werden.
BMP
Dieses wirkt normalerweise zusammen mit LIF und aktiviert den Transkriptionsfaktor Smad, welche die Expression Id induziert. Id ist eine Inhibitor für die Differenzierung.
Differenzierung muriner SZ in vitro:
1. Neuronen
2. Pankreatische Inselzellen
1. Stimulierung der Proliferation in vitro
- ES-Kultur mit FCSund LIF → Proliferation undifferenzierter embryonale Stammzellen in vitro
2. Gerichtete Differenzierung in vitro (EB, Selektion, Expansion, Differenzierung)
- Passage in einer dichter Suspensionskultur → Embryoid bodies: Zellinteraktion führt zur Signalstoffaustausch und Signalgradienten, induziert Differenzierung in allen 3 Keimbahnrichtungen.
- Selektion von Nestin-(+)-Zellen in ITSFn-Medium (Insulin, Transferrin, Selenit, Fibronectin; serumfreies Medium). Die meisten Zellen sterben hier ab, aber es führt dazu dass Nestin+ Zellen überleben und angereichrt werden. Nestin ist ein Marker für neuronale und pankreatische Vorläuferzellen
- Expansion/Vermehrung der Nestin-(+)-Zellen in N2-Medium, B27 Zusatz, bFGF (bFGF: mitogen, SHH: morphogen, FGF-8: WF)
- Entfernen von bFGF, Nicotinamid → Zellen proliferieren nicht mehr, sondern differenzieren in vorgegebene Richtung (neuronal, pankreatisch)
=> RT-PCR-Analyse + Immunmarkierung zur Überprüfung
Differenzierung humaner SZ
- Embryoid bodies: Selektions-, Expansions- und Differenzierungsphase (wie bei murinen SZ)
Dabei wird Shh/SAG, RA zum Medium zugebeben, um die Differenzierung in Motorneuronen zu gewährleisten. Nach der Differenzierung kann diese Motorneuron durch Zugabe von GDNF, BDNF weiter differenziert werden => Motorneurone bilden damit Axone aus und Axone verlängern sich.
- neuronalen Rosetten: adhärente Kultur
Rosettenstruktur taucht bei der embryonalen Entwicklung auf (in vivo) => bei der Reifung von Blastocyt => in Epiblast bildet sich ein Rosettenstruktur in einem Übergangsstadium.
Gene editing für immunkompatible PSZ-basierte Therapien
Eine fremd Stammzelle wird vom Empfängerimmunsystem durch HLAs erkannt und beseitigt, da sie nicht kompartibel ist, wenn das Empfängerimmungsystem nicht suprimmiert ist (keine ständige Lösung). NK-Zellen erkennen Oberflächenstrukturen und lysieren die Stammzellen. Makrophagen erkennen diese Stammzellen und diese werden phagocytiert.
- Möglichkeit: mit den induzieten pluripotenten Stammzellen arbeiten, die von Patient selbst stammen
- Möglichkeit: ein Derivat generieren, die mit jedem Immunsystem kompatibel ist
- Möglichkeit: Geneditierung: so modifizieren, dass die bestimmte Erkennungsstrukturen auf Stammzellen nicht mehr vorhanden sind.
Dafür z.B. deletiert man die Gene für HLA-1 und HLA-2. Sie präsentieren gar nicht diese Kompatibilitätstrukturen an der Oberfläche und damit sind sie für diesen Arm des Immunsystems unsichtbar/nicht-fremd.
Dabei kann man auch in diesem Genlokus von HLA andere Strukturen (PD-L1, HLA-E, CD47) integrieren, die die Immunzellen abzuhalten => z.B. Makrophagen nicht andocken oder NK-Zellen kein Kontakt aufnehmen können, T-Zellen nicht aktiviert werden.
Next generation Stammzellaplikationen
- Geneditierung um Immunkompatibilität herzustellen
- Stammzellen als „Drugcarrier“
- Stammzellen, die optogenetisch mit entsprechenden Strukturen (Oberflächen- oder Membranproteine der Zellen) gekoppelt sind: Über Licht können diese Stammzellen aktiviert werden. Sie sind lichtsensitiv und verändern ihre Konformation. Mit sowas kann man über Strahlung die Signalwege an- und ausschalten.
- CAR-T-Zellen: CAR: Chimeric Antigen Receptor => gentechnologisch veränderte T-Zellen mit synthetischen antigenspezifischen Rezeptoren. Sie werden in Membran integriert und können auf die Targetzellen abgestimmt werden. Sobald diese CAR-Rezeptor angedockt wird, wird die T-Zelle aktiviert und diese aktiviert das Immunsystem weiter.
- Engineerte Stammzellen, die verschiedene Wachstumsfaktoren exprimieren (z.B. für die Mundheilung)
Organoide
Def:= mikroskopisch kleine Organe als Modelsysteme
Generierung:
- Kultivierung der Stammzellen
- Bildung der Embryoid bodies in Suspension
- Differenzierung wird induziert
- Diese kleine Gewebstrukturen werden genommen und in Matrigel (aus Maus, wie Bindegewebe) gestellt
- Differenzierung dieser Stammzellen in entsprechende Organrichtung (durch Zusatzstoffe, Signalstoffe zur richtigen Zeit), z.B. Zugabe von Aktin A, um Mesodermderivate zu enthalten
- Gewebsstruktur wird in einer Spinnerkultur gestellt, welche dafür sorgt, dass die Zellen dauernd in Suspension bleiben
- Enstehung des Organoids
Determinanten der SZ Entwicklung
1. Qualitative Determinanten: Spezifische Faktoren, die man in Kultur bringt, helfen Pluripotenz beizubehalten oder Differenzierungswege einzuleiten. specific factor, specific fate => Kreuzantagonismus
2. Quantitative Determinanten: Wie viel soll von Faktor/Signalstoff zur Kultur zugegeben werden?
- Absolute Konzentration der Signalstoffe
- Relative Konzentrationsänderung der Signalstoffe. Es gibt einen Schellenwert. Oberhalb: Selbsterneuerung. Unterhalb: Differenzierung
3. Zeitabhängige Determinanten
- Window of oppurtinity: Begrenzter Zeitfenster der Rezeption spezifischer Stimuli
- Signaldynamik: Rate und Dauer der Signalaktivierung oder deaktivierung regulieren weitere Zellentwicklung.
4. Räumliche Determinanten: Stammzellennische mit fixiertem und ortsgebundemen Signal (definierte Umgebung der SZ):
- Signal durch direkten Zell-Zell-Kontakt mit Support-Zellen
- Regulation exogener Signale durch Positionierung der Zellen in lokalen Gradienten löslicher Faktoren
Kreuzantagonismus: PU1 und GATA1
- Wenn ein Transkriptionsfaktor hochgefahren wird, dann wird der andere (antagonistische) inhibiert.
- So ein Transkriptionsfaktor ist selbstreguliert und fördert seine eigene Expression.
- Jede von dieser Faktor haben bestimmte Zielgen, die duch Faktor gefördert werden => Inhibierung der antagonistische Faktorgene!
- Wenn Expression des Faktors PU1 gefördert wird, dann werden die Gene von Faktor GATA1 inhibiert.
Transdifferenzierung (Fibroblasten zu Pankreaszellen)
Bei der Transdifferenzierung kann man eine ausdifferenzierten Zelltyp in eine andere ausdifferenzierten Zelltyp direkt umprogrammieren, ohne wie bei iPS den Weg zurück auf Pluripotenz zu beschreiten und von da aus wieder die Differenzierungsprotokoll durchzuarbeiten.
Ablauf:
- Fibroblasten werden isoliert und ausplattiert (1 Tag).
- Dann wurden die Fibroblasten mit Enzyminhibitoren behandelt (18h): DNA-Methyltransferase-Inhibitor macht Promotoren zugänglich, führt dazu, dass diese Gene wieder epigenetisch neu organisiert werden können.
- Pankreaslinie wird induziert (Von Fibroblasten zur Pankreaszellen)
Umwandlung von Fibroblasten in Neuronen
Reprogrammierung: iPS Zellen werden durch Überexpression der Yamanaka Faktoren generiert. Gezielte Differenzierung durch Überexpression von linienspezifishen TFs führt zur Generierung von neuronalen SZ und neuronalen Vorläuferzellen und durch Zugabe von Morphogene zu neuronale Subtypen weiter differenzieren.
PM (pluripotenz Vermittelte) Transdifferenzierung (Weg nur halb zurücklegen): Überexpression von Yamanaka-Faktoren für eine begrenzte Zeit, um neuronale Vorläuferzellen
Transdifferenzierung/ direkte Reprogrammierung: Überexpression von linienspezifischen TFs
Es gibt unterschiedliche Protokolle, die unterschiedliche Faktoren verwenden, um das selbe Ziel zu erreichen, allerdings mit unterschiedliche Effizienz am Ende.
Anwendungen des tissue engineerings
- Klinischer Bedarf an Ersatzgewebe in ausreichende Menge
- Testorgane zB Testskin
- Erforschung pathologischer Zusammenhänge
- Untersuchungen zur Organogenese/Histogenese
Implantationsstrategien
- Direkte Implantation isolierter Zellen
- Implantation eines bioaktiven Trägerwerkstoffes zur Stimulierung des Einwachsens von Empfängergewebe
- Implantation eines Verbundes von Träger und gezüchteten Zellen oder Geweben
Prinzip des tissue engineerings
Lebende Zellen eines Organismus extrakorporal in vitro zu kultivieren, ggf. Mit extrazellulären Komponenten biologischer oder synthetischer Art zu kombinieren und die bioartifiziellen Regenerate oder Konstrukte wieder in den Organismus des Patienten zu implantieren.
