Zellkulturtechnologie

Funktion: 

• Transport von Nährstoffen
• Entfernung von Abfallprodukten
• Mechanische Stimulation

Systeme

• Perfusionssyteme
• Torationssyteme
• Hohlfasersysteme
• Gradientenkammer

1. In vitro generierter Hautersatzt

• Quelle: humanes neonatales Gewebe der Vorhaut
• Dermale Schicht: Fibroblasten (elastizität)
• Epidermale Schicht: Keratinozyten

- Ausaat von Fibroblaten auf semipermeabler Membran mit bovinem Typ I Collagen

- 6 Tage Inkubation. Fibroblasten bilden Matrixproteine. Verbindung mit Collage-Filamenten

- Aussaat von Keratinozyten auf Matrix. 4 Tage Inkubation

- Exposition an Gas-Flüssigkeitsschicht. 10 Tage

- Keratinozyten bilden Stratum corneum 

2. Herstellung autologer, humaner Herzklappen aus Herzzellen des Schweins im Bioreaktion

1. Kultur porciner Herzklappen in vitro
2. Entfernung der porcinen Herzzellen vom Kollagen-Schützgerüst
3. Besiedlung der verbleibenden Trägermatrix mit humanen Herzzellen (Bioreaktior)
4. Sukzessiver Austausch des tierischen durch Humankollagen

3. TE of cornea

Zellen aus Mundschleimhaut entnehmen, Kultivierung auf Feederzellen, nach Dissoziation vom Gewebsück hat man ein Epithel generiert in vitro. Auf das Defekte Auge implantieren.

Schaffung von Gewebekonstrukten mit vorgeformten Blutgefäßen, die nach der Implantation durch die Entwicklung von Verbindungen zu den bereits vorhandenen Blutgefäßen des Wirtsgewebes schnell durchblutet werden. 

- intern: Es kann sein, dass das implantierte Gewebsstück reduziert wird, was den Hypoxia Effekt stimuliert dh Zellen im tissue engineerten Stück signalisieren dass sie mit Sauerstoff unterversorgt sind, das stimuliert die gesamte Umgebung mit den unterschiedlichsten Zellen die im Körper vorhanden sind, dass sie im engineerten Gewebestück Einwachsen und Verbindungen zu den Gefäß aufbauen sollen

- extern: Das in vitro Gewebstück ist funktionalisiert mit entsprechenden Faktoren, dass dafür sorgen, dass künstlich installierten Gefäße in den Patienten reinwachsen und sich aufbreiten.

Schichtweise additive robotische Biofabrikation von dreidimensionalen funktionellen lebenden Makrogeweben und Organkonstrukten unter Verwendung von Gewebesphäroiden als Bausteine.

Untersuchung und Quantifizierung der Wirkung von Prüfungssubstanzen auf Zellen, Gewebe oder Organe

Vergleich mit Tierversuchen (Vorteile):

• Reduktion oder Ersatz von Tierversuchen
• Multiple Assays (Variationsmöglichkeiten, statistiche Absicherung)
• Untersuchung auf molekulare Ebene (intra-, interzellulär)
• Reduzierte Kosten
• Verfügbarkeit von Humanmaterial 
• Aussagekraft?

• Aufschluss über Dosis-Wirkungsbeziehung (linear; Korrelation)
• In vivo relevanter Konzentrationsbereich
• Reproduzierbar
• Geringere Variabilität
• Geringe/keine Toxizität von Assay-Komponenten
• Hinweis über Wirkung in vivo

• Zelltyp
• Kulturmethode
• Konzentration der Prüfsubstanz
• Expositionsdauer und Erholungsphase
• Endpunkte (Was für austattung habe ich, was ist im Labor zu verfügung)
• Aussage (Welche frage will ich beantworten, wie ausagekräftig ist das?)

• Adhärente Zellkultur (meisten Gewebszellen) zB SZ, Hepatozyten, Neurone, Tumorzellen
  • Problematisch: Resistenzbildung, Reparaurmechanismen
• Suspensionskulturen (Wenn das Immunsystem betrifft) zB Immunzellen
• Histotypische bzw. organotypische ZK zB Sphäroidkultur, Testskin
• Gewebekulturen zB Hautfragmente, Gewebeschnite
  • Toxizitätsparameter zB Freisetzung von Enzymen
• Organkulturen
  • Problematisch: ausreichend lange Kulturzeit, reproduzierbare Bedingungen, Variation der Replikate
• Organoide

• Die Zellen heften sich an der Substratoberfläche an. Wenn diese Anheftungsphase abgeschlossen ist, kann man mit den eigentlichen Assay beginnen. 
• Testsubstanz ins Kulturmedium in unterschiedlichen Konzentration zugegeben und inkubiert. Wie lange diese Inkubation dauert, hängt von der Wirksmechanismus der Substanz.
• Nach dieser Expositionsdauer wird Assay durchgeführt, Endpunkt bestimmt oder Fluoreszenz gemessen.
• Nach der Expositionsphase kann man auch eine Erholungsphase anschließen, wird aber oftmals nicht gemacht.
• Dazu muss man aber das Kulturmedium wechseln, so dass alle Wirkstoff im Medium entfernt ist, die nicht von Zellen aufgenommen wurde. Schädigungen können sich auch erst nach der Erholungsphase manifestieren.
• Anschließend wird das Assay ausgelesen.

- Vitalität

- Zellproliferation

- Apoptose

- Genexpression 

Bestimmung der Anzahl vitaler Zellen in einer Kultur oder einem Gewebe nach Exposition mit Prüfsubstanz

a) Nachweis der Membranintegrität 

• Exklusionsmethode: Geladene Farbstoffe treten nur durch defekte Membranen hindurch
• Fluoreszenzfarbstoffe: DNA bindend, nicht toxisch, nicht Membrangängig
• LDH-Assay
  • LDH normalerweise im Cytoplasma, bei Membranschädigung im Kulturüberstand 
  • Oxidation von Lactat zu Pyruvat unter gleichzeitiger Reduktion von NAD + zu NADH/H + 
  • Reaktion über Diaphorase gekoppelt an Umsetzung von Indikator-Substrat
  • Nicht-destruktiv, da Messung des Kulturüberstandes 
  • Je mehr Substanzen nach außen gedrungen sind im Kulturüberstand, umso mehr Substrat hat man, dh umso mehr Zellen wurden geschädigt

b) Metabolische Assays

• Fluoreszenz-Test: Hydrolysierung der membrangängige Komponente durch aktive enzymatische Aktivität (Acetylesterasen), die in der lebenden Zellen vorherrscht, in den toten Zellen aber nicht.
  • Die vitale Zelle fluoresziert in Folge der Hydrolysierung 
  • Gegenfärbung der toten Zellen mit nicht membrangängige Fluoreszenzstoffe
• MTT Test: Succinat Dehydrogenasen wandeln in aktiven Mitochondrien gelbliches MTT zum dunkelblauem Formazan
  • Inkubation mit Prüfsubstanz, Zugabe von MTT, Zellaufschluss, Photometrische Quantifizierung => Wenn viel abgestorbene Zellen vorhanden waren, wurden entsprechend viel weniger MTT umgesetzt.
  • Wendepunkt der Kurve (IC50) => spricht für unterschiedliche Konzentration bei verschiedene Zellen => Vergleichen von zwei verschiedene Zellen 
• Aufnahme von Neutralrot (in vitale Zellen): ungeladen, farblos, membrangänglich
  • Wenn der Farbstoff in Lysosomen gerät (pH 5), wird es ionisiert (nicht mehr membrangängig) und bleibt in Lysosom (Ionenfalle). Zellen kann man mikroskopieren oder Farbstoff extrahieren und photometrisch messen. Wenn die Zellen rot sind, dann sind sie vital.

Bestimmung der Anzahl sich aktiv teilender Zellen in einer Kultur oder einem Gewebe 

• Immunologische Proliferationstest: Antikörper gegen Proteine des Zellzyklus
  • Cycline (Konzentration von Cyline hängt von den bestimmten Phase des Zellzyklus, also nicht konstant)
  • Ki67 (assoziiert mit allen Zellzyklusphasen. wenn die Zelle sich nicht mehr in Zellzyklus befindet, dann geht die Konzentration von Ki67 runter)
  • PCNA (hält DNA Polymerase in der S Phase am DNA Strang)

• Proteingehalt
  • Zunahme als Indiz für Proliferation
  • Bradford assay: Zellzahl einstellen => Prüfsubstanz applizieren/inkubieren => Zellaufschluss mit SDS => Kalibrationskurve mit Proteinstandard
  • Wachstumsinhibition > 30 % → toxisch

• DNA-Synthese 
  • Radioaktiv markiertes Thymidin bzw. Uridin wird zugegeben
    • Zellen werden nach einem Tag mit NaOH lysiert
    • Quantifizierung der DNA-Menge die repliziert wurde, im Scintillationszähler
  • Nicht-radioaktiv: Bromdesoxyuridin BrdU
    • Kompetition mit Thymidin 
    • Immunchemische Markierung von Bromdesoxyuridin => Nachweis der Integration

• Analyse der Zellzyklusphasen: Effekt der Wirkstoffbehandlung auf Zellzyklus
  • Bromdesoxyuridin markiert Zellen in der S Phase
  • Propidiumiodid, färbt Zellen in alle Stadie, Färbung proportional zur DNA Menge
  • FACS

- Serumentzug: Mitogen wird aus Medium rausgenommen => Ohne Mitogene & Wachstumsfaktoren gehen die Zellen aus dem Zellzyklus raus. 

- Zugabe von Inhibitoren des Zellzyklus: “Zellzyklusgifte” zugeben. Blockieren Zellen in einer bestimmten Phase

• Blockierung in S Phase: Phasethymidin, Aminopeptin
• Blockierung in M-Phase: Nocodazol. 

- Elutiation: Zellen nach Dichte separieren => entsprechend je nach Größe und Dichte eluiert. Je nach Zellzyklusphase verändern die Zellen ihre Größe

Zellschädigung verfassen

Apoptose assay: Verbrauch von ATP mit Luciferase Assay

• ATP-Gehalt sinkt sehr stark bei der Apoptose. 
• Signal: Bioluminiszenz
• ATP & O2 & Luficerase wandeln Luciferin in Oxlyluciferin um 
• Dabei wird Licht erzeugt und diese lässt sich verfassen
  • Je mehr ATP in der Zellen vorhanden ist, umso höher ist Signal. Tote Zellen produzieren entsprechend sehr geringe Signal. 

Annexin V Propodium Assay:

• Membran einer apoptotischen Zellen verändert sich. Membrankomponenten verändern ihre Lage (z.B. Phosphatidylserine, die in vitalen Zellen nach innen zeigen, flippen und zeigen außen bei der Apoptose). Diese extrazellulär exponierte Phosphatidyserine (PS) kann mittels Annexin erfasst werden. Diese markierte Annexin bindet selektiv an PS. Signal wird ausgelesen. 
• Je mehr Annexin-Signal, desto mehr Zellen befinden sich in Apoptose. 
• Färbung mit Propidiumiodid der membranenthüllten Vesikeln => zur Erfassung von sekundäre Nekrose.

Caspase Aktivität: 

• Fluoreszenzmarkierte Caspase-Substrat => Sobald Caspase diese schneidet, dann wird diese Fluoreszenz von der Peptid frei => Fluoreszenz wird gemessen. 
• Je mehr Signal, desto mehr Zellen befinden sich in der Apoptose. 

Tunel Assay: DNA Fragmentierung

• Bei der Apoptose wird DNA fragmentiert und diese führt zu freien Nukleinsäure-Enden (3’-OH-Gruppen werden freigesetzt). Diese kann man mithilfe von einem Enzym, Deoxynucleotidtransferase, markieren. Diese markierte Enden werden mit BrdU erfasst. Gehalt an BrdU kann mit gelabelte Antikörper gemessen werden. 
• Je mehr Fluoreszenzsignal, desto mehr Doppelstrangbrüche

z.B. Cis-Reporter System

Zellen werden gentechnisch verändert, sodass sie ein Reporterplasmid tragen (Fluorophor). Man misst ob bestimmter Signalweg aktiviert ist. Durch externe Stimuli werden Transkriptionsfaktoren aktiviert, die dann am Response Element binden und dieses Response Element packt man am Reporter Plasmid. Wenn Signalweg aktiviert, dann wird der Reporter exprimiert.

1. DNA Microarrays

2. Zellen Microarrays

3. Tissue arraysº

• Klonale Vermehrung und Erhaltungszüchtung
• Neuzüchtung
• Phytopathologie
• Produktion von Pflanzeninhaltsstoffen, z.B. Arzneistoffe, Zusatzstoffe für Nahrungsmittel, Kosmetika
• Produktion von rekombinanten Proteinen (Molecular Pharming)
• Biokatalysatoren zur enzymatischen Umwandlung von Substraten zu höherwertigen Produkten („Metabolic engineering“)
• Weitere Anwendungen, z.B. Bioindikatoren für Umweltbelastungen, Wirkstoff-Screening, Bioremediation, lebende Biokatalysatoren, Biomasse....

• Mineralsoffe
• Vitamine
• Aminosäuren 
• Energie- und Kohlenstoff quelle
• Wachstumsregulatoren – Auxine, Cytokine. 
• Wasser
• pH 
• Osmolarität

exogen zugesetzte Phytohormone um die Entwicklung der Pflanzenzellkultur zu manipulieren. 

• Auxine = Zellstreckung

Physiologische Wirkung

- In niederer Konzentration: Förderung des Streckungswachstums von Koleoptilen, der Sproßacshsen und der Wurzel

- In höher Konzentration: Hemmung des Wurzel- und Sproßwachstums 

Nachteile natürliche Auxine: Nicht besonders stabil, teuer, lichtempfindlich

Synthetische Auxine: Stabile chemische Analoge

Auxin Response Factors (ARFs) binden a Auxin Response Elemente (ARE) in den Promotoren von Auxin Response Gene, und aktivieren so deren Transkription.

Dadurch werden AUX/IAA Proteine transkribiert. Bei nidrigen Auxin Konzentrationen binden Aux/IAA an ARFs und hemmen so die ARE vermittelte Gentranskription. 

Bei hohen Auxin-Konzentrationen bindet Auxin an den TIR1-Rezeptor (TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1) und stimuliert die Interaktion der Aux/IAAs-Proteine mit dem Ubiquitin-Ligase-Komplex SCFTIR1 (SKP1, CDC53/CULLIN, F-Box), wodurch ihr Abbau durch das 26S-Proteasom gefördert wird. Durch die daraus resultierende Verringerung der Aux/IAA-Proteine werden die ARFs von ihrer Hemmung befreit, was die Expression von auf Auxin reagierenden Genen (Auxin Response ON) auslöst. 

• Cytokine = Zellteilung

Phytohormone, die sich vom Aminopurin ableiten und (in Kombination mit Auxin) die Zellteilung stimulieren sowie die Zelldifferenzierung steuern.

Die Typ-B-ARRs wirken als Transkriptionsfaktoren, und ihre Phosphorylierung aktiviert die Transkription der Cytokinin-regulierten Gene, einschließlich der Typ-A-ARRs (Cytokinin-Response-ON). Phosphorylierte Typ-A ARRs aktivieren die negative Regulierung der Cytokinin-Signalgebung (Cytokinin-Reaktion OFF).

• Nicht differenzierte (meristematische) Zellen, zB in Knospen, Wurzeln
• Dedifferenzierung von Pflanzenzellen -> Entwicklung von sekundären Meristem

1. Meristemkulturen

2. Kalluskulturen

3. Suspensionskulturen

4. Organkulturen aus Kalli

5. Somatische Embryogenese

6. Protoplastenkultur

Die Typ-B-ARRs können die Transkription der Aux/IAA-Gene aktivieren und damit die Auxin-Signalisierung unterdrücken, während Komponenten der Auxin-Signalisierung (Hohe Auxinkonzentrationen) die Typ-A-ARRs aktivieren  und die Cytokinin-Signalisierung unterdrücken.

Bsp 1: Hairy root cultures

Blatt wird mit Agrobakterium rhizogenes infiziert. Wurzeln wachsen aus Blätter raus. Wurzeln in fl. MS Medium inkubieren

Anwendungen: 

• Produktion von Inhaltsstoffen
• Biomasse
• Langzeit stabile Kulturen

Bsp 2: Apikalmeristem

Eine einzelne Triebspitze oder ruhende Knospe wird sterilisiert und auf ein Nährmedium gelegt, wo sie als Trieb zu wachsen beginnt (Stadium I). Als Reaktion auf die Hormone im Nährmedium wird der Spross zur Verzweigung angeregt. Die Sprossäste werden geteilt und wiederholt auf frischem Medium rekultiviert (Stadium II), bis die gewünschte Anzahl von Sprossen entstanden ist. Dann werden sie entweder direkt in der Kultur bewurzelt (Stadium III) oder nach der Entnahme aus der Kultur bewurzelt (Stadium IV).

• Vegetative Vermehrung (Mikropropagation) -> Hier werden kleine Pflänzchen gemacht, das Ziel ist sehr viele von diese in eine kurzen Zeit zu erzeugen
• Gewinnung von virusfreiem Material

• Stammpflanzen: von denen Hunderttausende von Pflanzen stammen, wachsen in einem kleinen Gewächshaus, das an das Gewebekulturlabor angeschlossen ist 
• Anzucht: Von den Mutterpflanzen werden schlafende Knospen abgeschnitten und oberflächensterilisiert. Wenn sie auf das entsprechende Nährmedium gesetzt werden, beginnt der Prozess der Mikrovermehrung
• Vermehrung: Durch Unterteilung und Übertragung von mikrovermehrten Pflänzchen nimmt die Anzahl der Pflänzchen mit jeder Übertragung (Subkultur) exponentiell zu. Durch die Zugabe von Cytokininen ist es oft normal, dass sich die Pflanzenmasse im Labor alle 6 Wochen (je nach Pflanze) um das 7-9fache erhöht. Das Ziel dieser Phase ist die Maximierung der Sprossproduktion. Nach einer gewissen Zeit werden die Triebe abgetrennt und zur weiteren Vermehrung in ihre eigenen Behälter gesetzt. 
• Bewurzelung: Die Bewurzelung in der Kultur (in vitro) kann zugunsten der Bewurzelung außerhalb der Kultur (ex vitro) übersprungen werden. Dieses Tablett mit unbewurzelten Mikrosprossen wurde nun aus der sterilen Umgebung genommen. Die so genannten Mikrostecklinge werden zurechtgeschnitten und in eine Bewurzelungshormonlösung (Auxin) getaucht.
• Akklimatisierung: In diesem Stadium werden die Triebe aus der sterilen Umgebung entfernt und in Erde mit hoher Luftfeuchtigkeit gesetzt. Die Luftfeuchtigkeit wird allmählich reduziert, um die Pflanze abzuhärten. In der Regel haben die Pflanzen noch einige Resthormone in sich und zeigen oft ein starkes, üppiges Wachstum.

Kallus: Nichtdifferenzierter Zellkomplex (parenchymatisch) mit nicht gerichtetem Wachstum

Oberflächensterilisation (Na-Hypochlorid)

• Explantat aus kambialem Gewebe
• Inkubation auf semisolidem Nähragar (0,6-1 %), pH ca 5,6, Lichtabschluß, Raumtemperatur → Entwicklung eines Primärkallus
•  Subkultur (ca. 4 Wochen-Turnus)

Kallustyp Steuerbar durch Kulturmaßnahmen, z.B. Variation des Nährmediums (Änderung der Vitamin- und Phytohormonkonzentration)

Lockeren Kallus: Wenn man zb ein Übergang von Kalluskultur in Zellsuspension will

• besser definierbar
• experimentell leichter zugänglich
• industrielle Produktion von Naturstoffen
• klonierungsfähig
• kein Gradient im Nährmedium (Nährstoffe werden gleichmeäßig angereichert)
• höhere Wachstumsgeschwindigkeit
• meist bessere Produktraten

Suspensionskultur im Vergleich zu Kalluskultur hat deutlich früher ihre maximale Reaktionsleistung erreicht. Nach 2 Wochen ist es schon am peak (Höhere Produktionsleistung)

Kalluskultur dauert länger, bis es in vergleichbare Regionen vorkommt.

Veränderungen während einer in vitro-Kultur vegetativer Zellen (Kallus- oder Suspensionskultur) und damit eine aus der in vitro-Kultur resultierende Vielfalt

→ positiv und/oder negativ bewertet

Biologischer Hintergrund: Mutationsereignisse, Endomitose, Endoreplikation

Abhilfe → Konservierung des Pflanzenmaterials 

1) Reduktion der Wachstumsgeschwindigkeit

2) Cryo-Konservierung

Organogenese: Bildung von Organen (z.B. Wurzeln, Blättern, Sprossen)

auf einem bereits vorhandenem (meist anderem) Pflanzenorgan oder in vitro-generiertem Gewebe z.B.: Bildung von Adventivsprossen auf Kallusgewebe

Organe aus Kalle generieren durch manipulation von Wachstumsfaktoren: Mit unterschiedliche Konzentrationen kann man Kultur in gewünschte Richtung steuern

Einfluß von Phytohormonen auf die Morphogenese

Fester nähragar. Da können verschiedene Konzentrationen von den Wachstumsregulatoren sein. 

Induktion von Pflanzenzellen zur Bildung somatischer (nicht zygotischer) Embryonen (embryooden) in vitro

Die somatische Embryogenese ist eine Klonvermehrungstechnologie, die auf der Vermehrung der frühesten organisierten Strukturen in Pflanzen, den Embryonen, beruht. Somatische Embryonen werden aus somatischen Zellen (Samenembryonen) der ursprünglichen Explantate der Spenderpflanze erzeugt, gefolgt von einem Entwicklungsprozess, der mit der Vermehrung des initiierten somatischen Embryos als Reaktion auf Wachstumsregulatoren beginnt, bei den unreifen Embryonen kontinuierliche Teilungen durchlaufen und sich dadurch unbegrenzt vermehren. Die unreifen Embryonen gehen dann unter dem Einfluss von Wachstumsregulatoren und anderen Komponenten des Wachstumsmediums in den nächsten Entwicklungsschritt, die Reifung, über. In diesem Stadium haben die Embryonen aufgehört, sich zu teilen, und beginnen, Speicherprodukte anzusammeln, die es ihnen ermöglichen, den letzten Schritt des Prozesses in vitro zu durchlaufen, die Keimung

Bsp Protokoll: somatische embryogenese bei Soja

1. Induktion 

Auxin wird auf semisoliden medium gegeben, 

Induktion von Embryoide durch hohe Auxinkonzentrationen -> unsymmetrische Zellteilung

Embryonen: nach ca. 2 wochen, 6 Wochen Verbleibzeit auf Medium

2. Proliferation

Solid medium: Subkultur monatlich

Liquid medium: Subkultur 2-wöchentlich

3. Histodifferenzierung und Reifung

Histodifferentiierungs-Medium ("MSM6AC"):

Globular stage. Embryonen differenziren in ca. 1 Woche in diesem Medium (one Auxni) zum Cotyledonenstadium

Reifungs- Medium ("MSM6"): Ohne Aktivkohle

Verlust der grünen Farbe bei Erreichen der physiol. Reife - 6-8 Wochen nach Erreichen des Cotyledonen-Stadiums

4. Keimung

Pflanzenzellen ohne Zellwand

Eigenschaften: 

• Es liegen Einzelzellen vor
• Protoplasten lassen sich fusionieren, zB → Generierung von Hybriden
• Überwindung sexueller Inkompatibilität (Interspezies)
• Protoplasten lassen sich transformieren (→ transgene Plflanzen)
• Protoplasten regenerierbar zu vollständigen Pflanzen

Aus dem Mesophyll zweier genetisch verschiedener Ausgangspflanzen werden Protoplasten isoliert, hier über die Sukzedantechnik. Nach Verklebung fusionieren Protoplasten aus A und B zusammen zu einem Heterokaryon. Im Verlauf der ersten Teilung des Heterokaryons kommt es auch zur Verschmelzung der Zellkerne. Die Selektion auf Hybriden setzt in der Regel an Hybridzellen an, die sich aus Hybridprotoplasten entwickelt hatten. über selektionierten Hybridkallus wird eine somatische Hybride A+ B regeneriert.

Ausgehend von Hybride kann man Pflanzen regenerieren über Kalli. Diese Pflanzenhybride haben kombinierte Eigenschaften aus die davor separate Pflanzen. 

Cytoplasma von 2 unterschiedlichen Pflanzen wird fusioniert. Fusionsprodukt in gegenwart von herbizid selektieren.

Cybridisierung zum Einbringen von Metribuzun-Resistenz in Doppelnull-winterraps. Donor (A): Somerraps mit Metribuzinresistenz (Gene in den schwarz gehaltenen Chloroplasten). Rezeptor (B): Doppelnull-Winterraps. Bei der Entwicklung der Fusionsprodukte kann es zu einer Entmischung (Segregation) den beiderseitigen Chloroplasten kommen.