Analytische Chemie 1 - ZHAW Biotechnologie

Die Zellkonstante \(k = {L \over A}\) ist bei demselben Sensor immer gleich. Sie kann über eine Standardlösung mit dem Leitwert G bestimmt werden.

\(G*k = G { L\over A } = \kappa\)

In der Praxis wird oft die Wheatstone'schen Brückenschaltung benutzt, um die Leitfähigkeit von Lösungen zu bestimmen.

Zwischen A und B wird nun eine Spannung angelegt. Die beiden Widerstände R1 und R2 sind konstant. RA ist veränderlich und bei RM wird schlussendlich der Widerstand gemessen (sprich, RM ist die zu messende Flüssigkeit). Das Ziel ist nun, den Quotienten aus R1 und R2 mit dem Quotienten aus RA und RM  gleichzusetzten, sodass zwischen den Punkten C und D keine Spannung anliegt.

Bruder kei ahnig

• decken grossen Messbereich ab
• die bei höheren Leitfähigkeiten störenden Polarisationseffekte haben keinen Einfluss auf das Messergebnis

Es werden zwei Ringkernspulen eingesetzt, bei denen eine durch eine Wechselspannung einen Strom in der Messlösung induziert. Je höher die Leitfähigkeit der Lösung ist, desto höher ist deren induziertes magnetisches Wechselfeld. Das Wechselfeld wird seinerseits von einer Empfängerspule registriert.

Es werden zwei Leitfähigkeitssensoren benutzt, zwischen denen eine 220 nm UV-Lampe angebracht ist, die organische Verbindungen in CO₂ und Wasser oxidiert. Durch das Carbonat-CO₂-Gleichgewicht kann nun die Differenz der Leitfähigkeit gemessen werden, was dem TOC entspricht.

• Druchflusszytometrie (Charakterisierung von Zellen)
• Fluoreszenz- oder Infrarotspektroskopie (Moleküle in Zellen, Rückschlüsse auf Metabolismus)
• Trübungssensoren
• Dielektrische Spektroskopie (Zellzahl und -grösse)

• Standardmethode zur Bestimmung der Biomassekonzentration
• Streuung des Lichts wird gemessen, korreliert mit der Anzahl an suspendierten Zellen
  • Partikel, die kleiner sind als die Wellenlänge des Lichts, streuen das Licht seitwärts und vorwärts
  • grössere Partikel streuen das Licht zur Quelle zurück
• Gemessen wird die optische Dichte, meistens bei 600 nm, der OD entspricht \(OD = \log({I_0 \over I })\)
• OD verhält sich proportional zur Zelltrockenmasse, hohe Konzentrationen müssen aber verdünnt werden

• Anlegung eines elektrischen Wechselfelds mit wechselnder Frequenz
• lebende Zellen lassen sich polarisieren (ähnliches Verhalten wie ein Kondensator)
  • bei hohen Frequenzen des Wechselstroms werden die Zellen leitend
• Kann nicht ohne weiteres von einem auf andere Organismen übertragen werden

Biosensoren haben eine biologische (oder "natürliche") Erkennungskomponente. Dies können Organismen oder Teile davon sein. Die Erkennungskomponenten können mit einem Umwandler verbunden, oder direkt in diesen integriert sein.

• Enzyme auf einer Oberfläche Immobilisiert
• Geschwindigkeit der Reaktion, die durch die Enzyme katalysiert werden gilt als Mass der Konzentration den Substrats
• Reaktionsgeschw. lässt sich über den Elektrolysestrom messen -> amperometrische Transduktion
  • meistens aber nur indirekt über den Verbrauch des Oxidationsmittels bzw. des Nebenprodukts

• Beruhen auf Wechselwirkungen (Komplexbildung) zwischen Probemolekülen und biologischen Komponenten
• Ausmass der Komplexbildung korreliert mit der Analytenkonzentration
  • Änderung der Eigenschaften der Sensoroberfläche (Brechungsindex, Fluoreszenzemission etc.)
• z.B. Immunosensoren oder DNA-Microarrays

• Unspezifische Bindung durch Adsorbtion -> Sensor in Lösung getaucht, die die biologische Substanz enthält.
  • meist weniger beständig
• Kovalente Bindungen der Enzyme oder AK weisen eine höhere Langzeitbeständigkeit auf, können aber die Funktion der Enzyme stören
• Self Assembled Monolayers aus Alkylketten auf Gold-Oberflächen sind gut geeignet
• Kohlepasten oder leitfähige organische Salze können für Enzyme verwendet werden, die genug hydrophob sind

• Hohe Spezifität gegenüber dem Analyten
• Hohe Stabilität im Einsatz und während der Lagerung
• Unabhängigkeit der Reaktion von physikalischen Parametern wie pH-Wert, Temperatur oder Rühren
• Ansprechverhalten mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, mit Vorteil lineare Kennlinie
• Keine Probenvorbehandlung (Verdünnung, Filtration, Aufkonzentrieren)
• Hohe Reversibilität, d.h. sowohl aufsteigende als auch abnehmende Konzentrationen werden erfasst
• Preisgünstig, klein und einfach in der Bedienung
• Nicht anfällig auf Fouling oder Proteolyse

• Katalytische Oxidation von Glucose zu Gluconolacton, wobei Wasserstoffperoxid hergestellt wird
• Wasserstoffperoxid wird elektrochemisch bestimmt
• hohes Potential aufgrund von hohem Standardreduktionspotentials nötig
  • dadurch relativ grossen Einfluss von Störsubstanzen, die dabei ebenfalls oxidiert werden

Bei Biosensoren zweiter Generation werden die Elektronen, die auf das Enzym übertragen wurden, direkt an die Elektrode übertragen. Dies läuft über Mediatoren ab. Mediatoren sind Redox-Aktive Verbindungen. Sie stellen den Kontakt zwischen Enzym und Elektrodenoberfläche her.

Im Vergleich zu den Sensoren erster Generation sind diejenigen zweiter Generation weniger anfällig auf Interferenzen.

kurze Lebensdauer der Enzyme

Einmalanwendungen (wie z.B. Glucosemessung bei Diabetikern) sind ein geeignetes Einsatzgebiet von Biosensoren. Dabei werden Glucoseoxigenasen auf einen Teststreifen gedruckt.

Teststreifen für die Glucosebestimmung im Urin haben zusätzlich zur Glocoseoxigenase eine Peroxidase, die das entstehende Wasserstoffperoxid reduziert, was eine Vorstufe eines Farbstoffs bildet. Durch eine Farbreaktion kann anschliessend die Konzentration bestimmt werden.

• Berechnung der Konzentration der aufgestockten Lösung mit der Formel der Kalibration

\(x = {y + b \over m}\)

• Einsetzen der (auf die Lösungsmenge angepassten Konzentration) in die folgende Formel

\(WFR = {x_{Konz, aufgestockt} - x_{Aufstockung} \over x_{Konz, Probelösung}}\)

• Homogenisierung des Probegutes
• Ziehen von verschiedenen Proben an verschiedenen Orten
  • getrennt Analysieren und Mittelwert
  • vor Analyse vereinigen, danach Mittelwert bilden

• Homogenisieren der Probe
• Eliminieren von Interferenzen
• Konzentrationsbereich des Analyten in den Arbeitsbereich des Messgeräts bringen

Für das Erstellen einer Kalibrationskurve/Eichgerade wird eine Reihe von Standardlösungen (meistens decadische abnehmende Konzentrationen) gemessen und daraus eine Eichgerade durch das least-square-Verfahren erstellt. Diese ordnet jedem Messwert x ein Rohsignal y zu. Mit der Umkehrfunktion kann bei der Messung der Probe auf die Konzentration geschlossen werden.

Damit das least-square-Verfahren für eine lineare Regression benutzt werden kann, muss ein linearer Zusammenhang zwischen Messwert und Rohsignal vorhanden sein.

Die Kalibrationsfunktion ist die Gleichung der Regressionsgerade, die Analysefunktion ist deren Umkehrfunktion.

Der Korellationskoeffizienten bzw. das Bestimmtheitsmass einer Regressionsgerade gibt Auskunft darüber, wie klein die Residuen (die Abstände der einzelnen Punkte zur Regressionsgerade) sind und damit, wie gut die Linearität der Messungen ist.

Während der Korrelationskoeffizient ein Mass für die Beziehung zwischen zwei Variablen ist, gibt das Bestimmtheitsmass (auch Determinationskoeffizient genannt) Aufschluss darüber, wie viel Varianz durch die Regression erklärt wird.

Der Blindwert ist der Wert, der gemessen wird, wenn die Probe keinen Analyten enthält. Der Messwert sollte dabei tief sein.

Die Empfindlichkeit entspricht der Steigung m der linearen Regressionsgerade. Je steiler die Gerade, desto genauer kann eine Änderung Δx der Konz. des Analyten aufgelöst werden/desto empfindlicher reagiert das Signal auf eine Änderung des Analyten in der Probe.

Die Wiederfindungsrate sagt aus, welche Menge eines Analyten nach der Probenvorbereitung gefunden wird. Dies wird ermittelt, indem eine bekannte Menge Analyt einer Probe hinzugefügt wird und diese mit einer Probe verglichen wird, die keine Aufstockung durchlaufen hat.

Die Wiederfindungsrate berechnet sich wie folgt:

\(WFR = {m _{Probe, aufgestockt} - m_{Probe}\over m_{Aufstockung}}\)

Wobei die Aufstockung jeweils auf die Konzentration der Probe hochgerechnet werden muss.

Die Richtigkeit beschreibt die grundsätzliche Abweichung vom effektiven Wert. Die Abweichung verschiedener Messungen müssen also im Mittelwert möglichst nahe beim effektiven Wert liegen, wenn die Richtigkeit hoch sein soll.

Die Genauigkeit/Präzision beschreibt die Abweichung von verschiedenen Messungen vom gleichen Analyten. Hat ein Messgerät eine hohe Präzision, liegen die Messwerte nahe beieinander, habe also eine geringe Abweichung voneinander.

Die Nachweisgrenze ist die Konzentration, bei der mit einer bestimmten statistischen Sicherheit nachgewiesen werden kann, dass der Analyt vorliegt.

Die Bestimmungsgrenze ist die Konzentration, ab welcher die Konzentration eines Analyten mit einer bestimmten statistischen Sicherheit bestimmt werden kann.

Die Nachweisgrenze wird wie folgt berechnet:

\(b = {Y-Achsenabschnitt}\)

\(s_{b} = {Standardabweichung Blindwert}\)

\(y_{Nachweisgrenze}= {b + 3*s_{b}}\)

\(y_{Bestimmungsgrenze}= {b + 9*s_{b}}\)

Erkennung:

• In der sensitiven Schicht des Sensors findet eine Wechselwirkung zwischen dem Analyten und der immobilisierten Erkennungskomponente statt. Die Erkennungskomponente kann bspw. ein Ionophor sein, der Ionen komplexiert (Umhüllung von Ionen mit anderen neutralen oder polaren Stoffen) oder auch ein Enzym sein, dass Substrate spezifisch bindet.

Transduktion

• Durch die molekulare Erkennung des Analyten muss in eine physikalische Eigenschaft der sensitiven Schicht ändern. Die kann z.B. eine Ladung, eine Farbe, Dichte usw. sein.

Signalwandlung

• Oft muss die Messgrösse in ein weiteres (oft elektrisches) Signal umgewandelt werden. Es gibt jedoch einige Messgeräte, die die Messgrössen direkt aufzeichnen können.

• In-situ oder in-line: Sensor ist direkt im Prozess eingebaut/Bypasslösungen
• ex-situ, near-line oder off-line: Für die Messung wird eine Probe aus dem Prozess manuell oder automatisch entnommen und anschliessend analysiert
• Nicht invasiv: Einige Messungen können durchgeführt werden, ohne dass in den Prozess eingegriffen wird.

• Sensor
• Messkabel
• Armatur
• Messgerät
• Wartungssystem für CIP und Kalibration des Sensors
• Aufzeichnungs- und Steuereinheit bzw. Prozessleitsystem

Ziel des PAT ist es, kritische und qualitätsrelevante Prozessgrössen ohne Zeitverzug zu analysieren und zu regeln. Damit wird die Qualität bereits als integraler Bestandteil des Prozesses verstanden, wodurch auch mit variablen Eingangsgrössen eine gleichbleibende Qualität sichergestellt werden kann.

Chemische Sensoren:

• Kationen
• Anionen
• Gase

Biosensoren:

• Metbolite
• Antibiotika
• Vitamine
• Alkaloide

• Konduktometrie:
  • Anlegen einer Wechselspannung an Elektroden, Messung des Stroms zur Bestimmung der Leitfähigkeit von Elektrolyten. Je mehr Elektrolyte in der Lösung sind, desto besser wird der Strom zwischen den beiden Elektroden geleitet.
• Potentiometrie:
  • Messung der Potentialdifferenz zwischen zwei Elektroden, die Potentialdifferenz ist proportional zur Analytenkonzentration
• Amperometrie:
  • Messung eines Stroms, der durch Anlegen einer konstanten Spannung an eine elektrochemische Zelle entsteht.

• Ladungstransport: Kein Stoffumsatz
• Elektrochemischer Stoffumsatz: Reduktion/Oxidation

Ladungstransport:

• Konduktometrie (physikalische Analysemethode, die die elektrische Leitfähigkeit einer flüssigen Probe zur Bestimmung ihrer Inhaltsstoffe und deren Konzentration ausnutzt.)
• Potentiometrie (elektroanalytisches Verfahren der quantitativen Analyse unter Vermeidung eines Stromflusses und nutzt die Konzentrationsabhängigkeit der Leerlaufspannung)

Elektrochemischer Stoffumsatz:

• Amperometrie (Amperometrie in der Chemie ist der Nachweis von Ionen in einer Lösung basierend auf elektrischem Strom oder Änderungen des elektrischen Stroms.)
• Voltammetrie (Sammelbezeichnung für verschiedene elektroanalytische Methoden zur qualitativen und quantitativen Analyse einer Probe, mit der man die chemische Zusammensetzung von Stoffgemischen anhand des spannungsabhängigen Stromverlaufs bestimmen kann, sowie zur Aufklärung von Reaktionsmechanismen.)