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Sprache Deutsch
Stufe Universität
Erstellt / Aktualisiert 01.09.2021 / 01.09.2021
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Fluoreszenz vs. Phosphoreszenz

Fluoreszenz entsteht bei der Emission und hat eine sehr kleine Lebensdauer. 

Phosphoreszenz entsteht bei dem Rückkehr von Triplettzustand zum Grundzustand. Da zuerst die Spinumkehr stattfinden und danach Zurückfall in den Grundstand passieren soll, ist es zeitlich hinauszögert. Phosphoreszenz hat damit eine lange Lebensdauer. 

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Lambert-Beersche Gesetz

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Transmission: Die Intensitaet, die aus der Probe durchkommt

Absorpton: Strahlung wird in der Probe absorbiert, Intensitaet wird geringer 

Lambert-Beer'sche Gesetz: \(A = log(I_{0}/I) = \epsilon \cdot c \cdot d\)

 

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Welche Photometerarten gibt's? 

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Wofür werden Absorptionsmessungen gemacht?

  • Konzentrationen bestimmen
  • Identität des Analyst bestimmen
  • Detektion von Biomolekülen
  • Reaktionskinetik verfolgen/messen
  • Strukturaufklärung z.B. funktionelle Gruppen, alpha-Helix od. beta-Faltblatt bestimmen
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IR-Spektroskopie

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  • 760 nm - 1000 µm 
  • Anregung von Schwingungsniveaus (diskrete Schwingungszustaende) & Rotationsniveaus bei FIR
  • IR-Aktivitaet: nur die Schwingungen sind IR-aktiv, die das Dipolmoment aendern.
  • Je mehr Atome im Molekül, desto komplexer ist IR-Spektrum
  • Charakteristische Banden der funkt. Gruppen & Peptidgruppen, z.B. FAB-Fragment & Schwingungsarten
  • IR-Spektroskopie von Zellen, z.B. Unterscheiden zw. Tumor- und Gewebezelle
  • Absorptionsmessung wird in gleicher Richtung wie einstrahlendes Licht gemessen. 

Anwendung:

  • Gleich wie Absorptionsspektroskopie
  • Ist das Protein richtig gefaltet oder nicht? Wurde es rekombinant hergestellt? 
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IR-Aktivitaet

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Schwingungsenergie wird nur dann aufgenommen, wenn sich das Dipolmoment aendert.

Schwingungsfreiheitsgrad: 3N-6, bei linearen Molekülen 3N-5

 

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UV/VIS-Spektroskopie

  • Anregung elektronischer Übergaenge (aeußere oder delokalisierte Elektronen werden angeregt) => Elektronen werden in angeregte Zustaende überführt, z.B. von S0 in S1 (Frank-Condon Prinzip)
  • Wellenlaengenbereich: 100-760 nm
  • Bei Proteinen: Peptidbindung (halbaromatische Systeme, Übergaenge von bindenden in antibindende Orbitale) & Aromatische Seitenketten (aromatische Systeme mit delokalisierte Elektronen) & prosthetische Gruppen, z.B. Retinal bei Rhodopsin
  • RNA/DNA bei 260 nm
  • Detektion von Peptiden/Proteinen in chromatographischen Trennungen durch Einzelwellenlaengenmessung => Jedes Protein hat einen unt. Extinktionskoeffizient, abh. von der Anzahl der aromatischen Gruppen bekommt das Protein eine höhere Absorptionswert => relativer Vergleich des gleichen Proteins in versch. Proben ist erlaubt 
  • Konzentrationsbestimmung von Peptiden/Proteinen, z.B. Kolorimetrie

Anwendung: 

  • Bestimmung des Gehalts
  • Strukturaufklaerung
  • Identitaetsprüfung
  • Reaktionskinetiken und -intermediate
  • Detektion von Biomolekülen 
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Fluoreszenzspektroskopie 

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  • Emissionsspektroskopie
  • Frequenz der Fluoreszenz ist immer kleiner, also energieaermer (größere Wellenlaenge) als die vorangegangenen Absorption (Rotverschiebung, stokes shift wegen Schwingungsrelaxation, strahlungsloser Übergang)
  • Schwingungsrelaxation zw. Schwingungsniveaus, Fluoreszenz/Phosphoreszenz bei Übergaenge zw. elektronische Zustaende (Fluoreszenz, z.B. bei Übergang von S1 zu S0, Phosphoreszenz, z.B. bei Übergang von T1 zu S0)
  • Bei Emission sind die Schwingungsniveaus von S0 maßgeblich, da deren Wellenfunktion mit dem v = 0 von S1 überlappen soll. 
  • Emissionsmessung ist senkrecht zu einstrahlendem Licht.