Biochemische Analytik
Zusammenfassung & Altklausurfragen
Zusammenfassung & Altklausurfragen
Fluoreszenz vs. Phosphoreszenz
Fluoreszenz entsteht bei der Emission und hat eine sehr kleine Lebensdauer.
Phosphoreszenz entsteht bei dem Rückkehr von Triplettzustand zum Grundzustand. Da zuerst die Spinumkehr stattfinden und danach Zurückfall in den Grundstand passieren soll, ist es zeitlich hinauszögert. Phosphoreszenz hat damit eine lange Lebensdauer.
Lambert-Beersche Gesetz
Transmission: Die Intensitaet, die aus der Probe durchkommt
Absorpton: Strahlung wird in der Probe absorbiert, Intensitaet wird geringer
Lambert-Beer'sche Gesetz: \(A = log(I_{0}/I) = \epsilon \cdot c \cdot d\)
Welche Photometerarten gibt's?
Wofür werden Absorptionsmessungen gemacht?
- Konzentrationen bestimmen
- Identität des Analyst bestimmen
- Detektion von Biomolekülen
- Reaktionskinetik verfolgen/messen
- Strukturaufklärung z.B. funktionelle Gruppen, alpha-Helix od. beta-Faltblatt bestimmen
IR-Spektroskopie
- 760 nm - 1000 µm
- Anregung von Schwingungsniveaus (diskrete Schwingungszustaende) & Rotationsniveaus bei FIR
- IR-Aktivitaet: nur die Schwingungen sind IR-aktiv, die das Dipolmoment aendern.
- Je mehr Atome im Molekül, desto komplexer ist IR-Spektrum
- Charakteristische Banden der funkt. Gruppen & Peptidgruppen, z.B. FAB-Fragment & Schwingungsarten
- IR-Spektroskopie von Zellen, z.B. Unterscheiden zw. Tumor- und Gewebezelle
- Absorptionsmessung wird in gleicher Richtung wie einstrahlendes Licht gemessen.
Anwendung:
- Gleich wie Absorptionsspektroskopie
- Ist das Protein richtig gefaltet oder nicht? Wurde es rekombinant hergestellt?
IR-Aktivitaet
Schwingungsenergie wird nur dann aufgenommen, wenn sich das Dipolmoment aendert.
Schwingungsfreiheitsgrad: 3N-6, bei linearen Molekülen 3N-5
UV/VIS-Spektroskopie
- Anregung elektronischer Übergaenge (aeußere oder delokalisierte Elektronen werden angeregt) => Elektronen werden in angeregte Zustaende überführt, z.B. von S0 in S1 (Frank-Condon Prinzip)
- Wellenlaengenbereich: 100-760 nm
- Bei Proteinen: Peptidbindung (halbaromatische Systeme, Übergaenge von bindenden in antibindende Orbitale) & Aromatische Seitenketten (aromatische Systeme mit delokalisierte Elektronen) & prosthetische Gruppen, z.B. Retinal bei Rhodopsin
- RNA/DNA bei 260 nm
- Detektion von Peptiden/Proteinen in chromatographischen Trennungen durch Einzelwellenlaengenmessung => Jedes Protein hat einen unt. Extinktionskoeffizient, abh. von der Anzahl der aromatischen Gruppen bekommt das Protein eine höhere Absorptionswert => relativer Vergleich des gleichen Proteins in versch. Proben ist erlaubt
- Konzentrationsbestimmung von Peptiden/Proteinen, z.B. Kolorimetrie
Anwendung:
- Bestimmung des Gehalts
- Strukturaufklaerung
- Identitaetsprüfung
- Reaktionskinetiken und -intermediate
- Detektion von Biomolekülen
Fluoreszenzspektroskopie
- Emissionsspektroskopie
- Frequenz der Fluoreszenz ist immer kleiner, also energieaermer (größere Wellenlaenge) als die vorangegangenen Absorption (Rotverschiebung, stokes shift wegen Schwingungsrelaxation, strahlungsloser Übergang)
- Schwingungsrelaxation zw. Schwingungsniveaus, Fluoreszenz/Phosphoreszenz bei Übergaenge zw. elektronische Zustaende (Fluoreszenz, z.B. bei Übergang von S1 zu S0, Phosphoreszenz, z.B. bei Übergang von T1 zu S0)
- Bei Emission sind die Schwingungsniveaus von S0 maßgeblich, da deren Wellenfunktion mit dem v = 0 von S1 überlappen soll.
- Emissionsmessung ist senkrecht zu einstrahlendem Licht.
Fluoreszenz
- Intrinsische Fluoreszenz
Fluoreszenz geht vom Molekül direkt aus, welche abhaengig von der molekularen Umgebung ist. Meistens Tryptophan bei Proteinen.
- Fluoreszierende Biomoleküle
Naturstoffe, z.B. Bilirubin; Proteine, z.B. GFP
- Extrinsische Fluoreszenz
Fluoreszenz geht von eingebauten Chromophoren aus (Fluoreszenzsonden), die durch:
- Interaktion (Wechselwirkungen) mit dem Chromophor
- chemische Reaktion mit dem Chromophor
- genetisches Einbringen, z.B. Fusionprotein mit einem GFP-Tag
- immunchemische Reaktion, z.B. Antikörper, welche Protein bindet und ein GFP beinhaltet
Fluoreszenz zeigen, z.B. DAPI.
Was ist Polarisation?
Die Polarisation einer Transversalwelle beschreibt die Richtung ihrer Schwingung. Ändert sich diese Richtung schnell und ungeordnet, spricht man von einer unpolarisierten Welle.
Sonnenlicht (polarisiertes Licht) enthält alle möglichen Richtungen von dem Feldvektor. Wenn es auf Material trifft, dann werden da Elektronen angeregt => danach findet Relaxation (Reflexion, Streuung, Emission) statt => senden Lichtwellen aus, die orthogonal zur Schwingungsrichtung der Elektronen (Ausbreitungsrichtung) stehen => bestimmte Polarisation des Lichtes.
Wie entsteht die Polarisation?
- Polarisationsfilter
Nur der Anteil des Lichtes der senkrecht zum Filter steht, wird durchgelassen.
- Optisch aktive Substanzen
Sie wirken aehnlich wie die Polarisationsfilter. Sie absorbieren Licht abhaengig von der Lichtpolarisation und ihrer atomaren/molekularen Umgebung.
Circulardichroismus (CD)
CD untersucht die unterschiedliche Absorption durch optisch aktive Substanzen (chirale Zentren).
Optisch aktive Substanzen absorbieren das links und rechts zirkulaer polarisiertes Licht unterschiedlich stark. Deswegen bildet sich bei denen ein elliptisch polarisiertes Licht, wenn beide summiert wird.
CD-Spektroskopie misst die Elliptizitaet in Abhaengigkeit von der Wellenlaenge. Absorption wird maximal (minimal) bei paralleler (senkrechter) Anordnung von einfallender Welle und absorbierendem Chromophor (aehnlich wie bei Polarisationsfilter).
Elliptizitaet = \(\Theta(\lambda) = const (\epsilon_{L} - \epsilon_{R}) \cdot c \cdot d\)
Cotton-Effekt
- Kurz vor Absorptionsmaximum schlaegt Elliptizitaet aus.
- Beim Absorptionsmaximum ist die Elliptizitaet null.
- Nach Absorptionsmaximum weiterer Ausschlag.
Zwei Enantiomere eines Moleküls zeigen einen gleich großen Cotton-Effekt aber mit verschiedenem Vorzeichen.
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Fluoreszenz vs. Phosphoreszenz
Fluoreszenz entsteht bei der Emission und hat eine sehr kleine Lebensdauer.
Phosphoreszenz entsteht bei dem Rückkehr von Triplettzustand zum Grundzustand. Da zuerst die Spinumkehr stattfinden und danach Zurückfall in den Grundstand passieren soll, ist es zeitlich hinauszögert. Phosphoreszenz hat damit eine lange Lebensdauer.
Lambert-Beersche Gesetz
Transmission: Die Intensitaet, die aus der Probe durchkommt
Absorpton: Strahlung wird in der Probe absorbiert, Intensitaet wird geringer
Lambert-Beer'sche Gesetz: \(A = log(I_{0}/I) = \epsilon \cdot c \cdot d\)
Welche Photometerarten gibt's?
Wofür werden Absorptionsmessungen gemacht?
- Konzentrationen bestimmen
- Identität des Analyst bestimmen
- Detektion von Biomolekülen
- Reaktionskinetik verfolgen/messen
- Strukturaufklärung z.B. funktionelle Gruppen, alpha-Helix od. beta-Faltblatt bestimmen
IR-Spektroskopie
- 760 nm - 1000 µm
- Anregung von Schwingungsniveaus (diskrete Schwingungszustaende) & Rotationsniveaus bei FIR
- IR-Aktivitaet: nur die Schwingungen sind IR-aktiv, die das Dipolmoment aendern.
- Je mehr Atome im Molekül, desto komplexer ist IR-Spektrum
- Charakteristische Banden der funkt. Gruppen & Peptidgruppen, z.B. FAB-Fragment & Schwingungsarten
- IR-Spektroskopie von Zellen, z.B. Unterscheiden zw. Tumor- und Gewebezelle
- Absorptionsmessung wird in gleicher Richtung wie einstrahlendes Licht gemessen.
Anwendung:
- Gleich wie Absorptionsspektroskopie
- Ist das Protein richtig gefaltet oder nicht? Wurde es rekombinant hergestellt?
IR-Aktivitaet
Schwingungsenergie wird nur dann aufgenommen, wenn sich das Dipolmoment aendert.
Schwingungsfreiheitsgrad: 3N-6, bei linearen Molekülen 3N-5
UV/VIS-Spektroskopie
- Anregung elektronischer Übergaenge (aeußere oder delokalisierte Elektronen werden angeregt) => Elektronen werden in angeregte Zustaende überführt, z.B. von S0 in S1 (Frank-Condon Prinzip)
- Wellenlaengenbereich: 100-760 nm
- Bei Proteinen: Peptidbindung (halbaromatische Systeme, Übergaenge von bindenden in antibindende Orbitale) & Aromatische Seitenketten (aromatische Systeme mit delokalisierte Elektronen) & prosthetische Gruppen, z.B. Retinal bei Rhodopsin
- RNA/DNA bei 260 nm
- Detektion von Peptiden/Proteinen in chromatographischen Trennungen durch Einzelwellenlaengenmessung => Jedes Protein hat einen unt. Extinktionskoeffizient, abh. von der Anzahl der aromatischen Gruppen bekommt das Protein eine höhere Absorptionswert => relativer Vergleich des gleichen Proteins in versch. Proben ist erlaubt
- Konzentrationsbestimmung von Peptiden/Proteinen, z.B. Kolorimetrie
Anwendung:
- Bestimmung des Gehalts
- Strukturaufklaerung
- Identitaetsprüfung
- Reaktionskinetiken und -intermediate
- Detektion von Biomolekülen
Fluoreszenzspektroskopie
- Emissionsspektroskopie
- Frequenz der Fluoreszenz ist immer kleiner, also energieaermer (größere Wellenlaenge) als die vorangegangenen Absorption (Rotverschiebung, stokes shift wegen Schwingungsrelaxation, strahlungsloser Übergang)
- Schwingungsrelaxation zw. Schwingungsniveaus, Fluoreszenz/Phosphoreszenz bei Übergaenge zw. elektronische Zustaende (Fluoreszenz, z.B. bei Übergang von S1 zu S0, Phosphoreszenz, z.B. bei Übergang von T1 zu S0)
- Bei Emission sind die Schwingungsniveaus von S0 maßgeblich, da deren Wellenfunktion mit dem v = 0 von S1 überlappen soll.
- Emissionsmessung ist senkrecht zu einstrahlendem Licht.
Fluoreszenz
- Intrinsische Fluoreszenz
Fluoreszenz geht vom Molekül direkt aus, welche abhaengig von der molekularen Umgebung ist. Meistens Tryptophan bei Proteinen.
- Fluoreszierende Biomoleküle
Naturstoffe, z.B. Bilirubin; Proteine, z.B. GFP
- Extrinsische Fluoreszenz
Fluoreszenz geht von eingebauten Chromophoren aus (Fluoreszenzsonden), die durch:
- Interaktion (Wechselwirkungen) mit dem Chromophor
- chemische Reaktion mit dem Chromophor
- genetisches Einbringen, z.B. Fusionprotein mit einem GFP-Tag
- immunchemische Reaktion, z.B. Antikörper, welche Protein bindet und ein GFP beinhaltet
Fluoreszenz zeigen, z.B. DAPI.
Was ist Polarisation?
Die Polarisation einer Transversalwelle beschreibt die Richtung ihrer Schwingung. Ändert sich diese Richtung schnell und ungeordnet, spricht man von einer unpolarisierten Welle.
Sonnenlicht (polarisiertes Licht) enthält alle möglichen Richtungen von dem Feldvektor. Wenn es auf Material trifft, dann werden da Elektronen angeregt => danach findet Relaxation (Reflexion, Streuung, Emission) statt => senden Lichtwellen aus, die orthogonal zur Schwingungsrichtung der Elektronen (Ausbreitungsrichtung) stehen => bestimmte Polarisation des Lichtes.
Wie entsteht die Polarisation?
- Polarisationsfilter
Nur der Anteil des Lichtes der senkrecht zum Filter steht, wird durchgelassen.
- Optisch aktive Substanzen
Sie wirken aehnlich wie die Polarisationsfilter. Sie absorbieren Licht abhaengig von der Lichtpolarisation und ihrer atomaren/molekularen Umgebung.
Circulardichroismus (CD)
CD untersucht die unterschiedliche Absorption durch optisch aktive Substanzen (chirale Zentren).
Optisch aktive Substanzen absorbieren das links und rechts zirkulaer polarisiertes Licht unterschiedlich stark. Deswegen bildet sich bei denen ein elliptisch polarisiertes Licht, wenn beide summiert wird.
CD-Spektroskopie misst die Elliptizitaet in Abhaengigkeit von der Wellenlaenge. Absorption wird maximal (minimal) bei paralleler (senkrechter) Anordnung von einfallender Welle und absorbierendem Chromophor (aehnlich wie bei Polarisationsfilter).
Elliptizitaet = \(\Theta(\lambda) = const (\epsilon_{L} - \epsilon_{R}) \cdot c \cdot d\)
Cotton-Effekt
- Kurz vor Absorptionsmaximum schlaegt Elliptizitaet aus.
- Beim Absorptionsmaximum ist die Elliptizitaet null.
- Nach Absorptionsmaximum weiterer Ausschlag.
Zwei Enantiomere eines Moleküls zeigen einen gleich großen Cotton-Effekt aber mit verschiedenem Vorzeichen.
