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V404A

Grundlagen der Mikrobiologie

Grundlagen der Mikrobiologie

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L. D.
Study
L. D.
Diese Lernkarten decken grundlegende und fortgeschrittene Konzepte der Genetik und Molekularbiologie auf Universitätsniveau ab. Sie behandeln Themen wie Genstruktur, DNA-Sequenzierung, Genexpression und -regulation, einschließlich der Rolle von Phagen, Operons und Mutationen. Die Karteikarten erklären auch Techniken wie PCR, RT-PCR, CRISPR-CAS-Systeme und verschiedene Sequenzierungstechnologien. Sie sind besonders nützlich für Studierende und Forscher, die ihr Verständnis der molekularen Mechanismen und genetischen Techniken vertiefen möchten.
Flashcards
109
Students
5
Language
German
Category
Biology
Level
University
Created / Updated
21.04.2021 / 24.01.2026
  • 1  / 109

Flashcards

Spaltung der Phagen-Nukleinsäure

  • Restriction modification (R-M) System nur in dsDNA-Phagen
    • Herstellung von Insulin
  • CRISPR/CAS-System bei RNA und DNA
  • DNA kann nicht geschnitten werden, wenn Methylierung vorliegt 

Erworbene Resistenz durch das CRISPR-CAS-System

  • Phage infiziert die Wirtszelle
  • Wenn die Zelle überlebt und die Phagen-DNA lysieren kann, dann wird ein Teil der Phagen-DNA in eine Spacer-Region eingebaut
  • Das Bakterium weiß jetzt, dass es von diesem Phagen befallen wurde
  • Mechanismus
    • Eingefügte Sequenz wird transkribiert und in kleine RNA-Moleküle (crRNAs) verpackt
    • Wenn es bei erneuter Infektion mit einem Phagen eine passende RNA gibt, dann wird die Phagen-DNA gespalten

Molekulares Wettrüsten

  • Resistenzmechanismen bauen sich auf, werden jedoch wieder zerstört
    • Häufig auch bei Pathogen-Wirt-Interaktion
  • E. coli und Phage T4 als Beispiel für Ko-Evolution

Selbstmord

  • Das abortive infection system (Abi) -> Rex-System
  • Ablauf
    • Phage infiziert und DNA interagiert mit einem Protein
    • Wenn RexA das Phagen-Protein erkennt, wird es aktiviert
    • Das aktivierte RexA aktiviert RexB (Ionenkanal)
    • Ionen werden herausgepumpt und der Zelltod wird ausgelöst

Das Genom eines Organismus umfasst

  • Alle Gene des Organismus
  • Deren regulatorische Sequenzen
  • Nicht-kodierende DNA

Sanger Sequenzierung (Didesoxy-Methode)

  • Dem Didesoxyzucker fehlt die 3’-Hydroxylgruppe (OH)
  • Wird ein ddNTP eingebaut, kommt es zum Kettenabbruch
  • DNA-Sequenz wird aus der Analyse der Fragmentlängen aus den 4 Einzelreaktionen rekonstruiert
  • Mittels Kapillarelektrophorese können Fragmente, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden, detektiert werden
  • Meist 700 – 800 bp, manchmal 1000 bp analysiert

Schrotschuss Sequenzierung

  • Genom wird in kurze überlappende Fragmente zerschnitten -> zufällig
    • Fragmentieren der DNA durch Scheren in einem Nebulizer (dünne Düse = Stränge zerreißen)
    • Oder Plastikstab, an den Ultraschall gelegt wird
  • Kurze Fragmente werden sequenziert und mittels Computeranalyse wieder zusammengesetzt (= assembliert)
  • Viele identische Sequenzen (= hohe Coverage) -> Fehlerrate ist sehr niedrig

Pyrosequenzierung

  • Keine Auftrennung mehr nach Größe, keine Unterbrechung
  • Jedes Mal, wenn ein dNTP eingebaut wird, wird ein Pyrophosphat abgespalten
  • Blitzmuster kann DNA-Sequenz rekonstruieren

Long-Read Technologien 

  • Bsp. MinION Technologie von Oxford Nanopore Technologies
  • DNA wird durch eine Protein-Pore in einer künstlichen Membran gezogen und die Sequenz online ausgelesen
  • Echtzeit-Sequenzierung
  • Sequenzierung von langen Strängen
  • Sind jedoch noch sehr ungenau
  • Ideal: eine Kombination aus genauen, kurzen Schrottschusssequenzen und ungenaue long reads

Genvorhersage und Annotation

  • Genvorhersage startet mit der Identifizierung von offenen Leserahmen (Computer)
  • Die Annotation weist Genen Funktionen zu
    • Proteine mit gleicher Funktion sind häufig evolutionär verwandt (homolog)
  • Um Annotation nachzuweisen wird die Genetik verwendet: z.B. Knockout-Mutanten, Expression eines Proteins, Aufreinigung etc.

Codon Bias

Organismus-spezifisch werden einige Codons häufiger verwendet als andere

Genome der Bakteria und Archaea: starke Korrelation zwischen Genomgröße und Anzahl von ORFs 

  • Kleineres Genom: stabile Habitate, metabolisch einseitig -> z.B. das Meer
    • Weiteres stabiles Habitat: Wirt-Parasit-Beziehung
  • Großes Genom: variable Habitate, metabolisch vielseitig (viele C-Quellen), komplexe Lebenszyklen -> z.B. der Boden

Mitochondrien und Plastide 

  • Enthalten reduzierte bakterielle Genome
  • Enthalten Proteinbiosynthese-Maschinerie
  • Endosymbiose
  • Plastidengenom: noch ca. 100 – 200 Proteine
  • Mitochondriales Genom: 13 Proteine
  • Endosymbiontischer Gentransfer
    • Im Laufe der Zeit haben die Mitochondrien und Plastide Gene verloren
    • Zusätzlich sind bakterielle Gene in den Zellkern eingebaut worden
  • Proteinimport: Protein wird wieder in das Organell gebracht

Kerngenome von (einzelligen) Eukaryoten

  • Große Vielfalt von Größen: intergenomische Sequenzen
  • C-value paradox: Die Komplexität eines Organismus (Hefe < Nematoden < Fliege < Mensch) korreliert nicht mit der Genomgröße
  • G-value paradox: Die Komplexität eines Organismus spiegelt sich nicht in der Anzahl der kernkodierten Gene wider

Metagenomik

Bezieht sich auf die Analyse von Genommischungen

  • Bakterien in einer Community können sich anders verhalten als in Reinkultur

Studie einer Community

  • Erster Ansatz: Community
    • Markergen: 16S rRNA 
    • Erstellung von Phylogenie-Stammbäume
  • Zweiter Ansatz: Umwelt
    • Rekonstruktion ganzer Genome -> kurze überlappende Fragmente, die später wieder zusammengesetzt werden
    • Entstehung von partiellen Genomen

SIP (stable isotope probing) in Kombination mit Metagenomik kann bestimmte metabolische Funktionen spezifischen Organismen(-gruppen) zuordnen

  • Bsp.: Community, die auf Cyanit wachsen kann
    • Cyanit = Atmungskettenhemmer
  • Anfüttern mit einem Substrat, wo der Kohlenstoff markiert wurde (13C schwerer als 12C)
    • Nur der Organismus, der das Substrat verwerten kann, baut diesen Kohlenstoff ein
  • Auftrennung mittels Caesium-Chlorid-Gradienten und Ultrazentrifugation
  • Extraktion und Analyse

Gen

  • DNA-Segment im Genom eines jeden Organismus
  • Besitzt ORF und Regulatorische Sequenzen (Promotor, Terminator)
  • Gene können vielfach benutzt werden

Genetic engineering

Veränderung der Struktur der Gene eines lebenden Organismus, um es gesünder, stärker oder nützlicher für den Menschen zu machen

Ziel: Expression eines Proteins (lac-System)

  • Möglich mit dem lac-System
    • pET-Plasmid: Gen, RBS und T7-Promotor = regulatorische Sequenzen
    • T7-Polymerasse, die von dem Stamm produziert wird, bindet an die RBS vom Plasmid
    • IPTG-Induktion kontrolliert die T7 RNA-Polymerase

Gene in Prokaryoten und Eukaryoten

  • Prokaryoten
    • Ein ORF für das Gen wird benötigt
    • Gene in Clustern -> man erhält polycistronische mRNA
  • Eukaryoten
    • Primäre Transkripte mit Exons und Introns
    • Durch Spleißen müssen erst die Introns entfernt werden, um die gewünschte mRNA zu erhalten

Amplifikation eines Gens

  • Startmaterial: gDNA
  • In vivo Klonierung: Amplifikation in Bakterien -> Restriktionsenzyme, ungezielt
  • PCR in vitro: Amplifikation in vitro -> gezielt

PCR

  • Gen der gDNA amplifizieren
  • Problem: Introns in eukaryotischen Genen
    • Bakterien können mit Introns nicht umgehen -> Genexpression gestört

RT-PCR

  • mit RNA starten 
  • Eukaryotisches Gen, dass für Bakterien zugänglich gemacht wird
  • mRNA wird in cDNA umgewandelt -> reverse Transkriptase
  • Komponenten für cDNA
    • polyA RNA
    • polyT Primer
    • Reverse Transkriptase

Restriktionsenzyme

  • EcoRI = sticky ends
  • EcoRV = blunt ends -> DNA-Fragmente können sich beliebig ausrichte

Kontrolle der Genexpression (Wirt)

  • Prokaryotischer Wirt
    • Promotoren und Operatoren -> Expression des Gens unter bestimmten Nährstoffbedingungen
    • Ribosombindestelle
    • Aktivierende und reprimierende Stellen
  • Eukaryotischer Wirt
    • Promotor
    • Introns können beibehalten werden -> Splicing
    • Export der mRNA vom Nukleus
      • Translation im Cytosol
    • Eukaryotische, translationale Kontrolle

Genfusion

  • Fusion von zwei Genen, verknüpft mit einer Proteaseschnittstelle
  • Fusion mit einem Protein (Carrier), dass für die Aufreinigung genutzt wird -> Bsp. malE
  • Spaltung mittels Protease gibt das Ziel frei
  • Carrier-Proteine formen keine Einschlüsse von Proteinen (inclusions)
  • Signal-Sequenz kann für die Sekretion hinzugefügt werden
    • Beim Export entfernt

Reinigung

  • Genfusion an einen HIS-tag

Reportergene

  • LacZ von E. coli kodiert ß-Galaktosidase
  • Fluoreszente Proteine für Expressionsstudien von Promotorfunktionen
  • Luciferase, um die die bakterielle Kolonisierung zu quantifizieren

Study