Biological Engineering
Biological Engineering, BMS, HS albsig
Biological Engineering, BMS, HS albsig
Was sind Aptamere?
DNA/RNA katalytisch aktiv durch 3D Struktur (Rückfaltung)
Erklären Sie das SELEX Prinzip zur Hestellung von Aptameren.
Aptamerbibliothek wird gegen Antigen gescreent, passende Aptamere werden amplifiziert --> ein Teil davon wird mutiert --> erneuter Durchgang --> screening um evtl. noch besseren Treffer zu erreichen
Nennen Sie die verschiedenen aktuell genutzten Haupttypen von Bindemolekülen (Scaffolds)
- AK Ähnliche (AK Fragmente)
- AK (MAK&PAK)
- andere Protein Scaffolds (Proteinbindemoleküle)
- Non-Protein Scaffolds (Aptamere)
- chemische Scaffolds (molekulares Imprinting)
Erklären Sie das immunologische Grundprinzip der Antikörperentstehuung in Säugetieren
T-Helferzellen (CD4+) durch APC aktiviert --> B-Zelle --> Antigen-bindender B-Zellenklon teilt sich nach Aktivierung --> (klonale Selektion) --> Aktivierte B-Zelle wird Plasmazelle --> Sekretiert Antikörper
Vorteile und Nachteile von MAK
+ gut etabliertr Produktion
+ nicht Patentgeschützt
+ auch mit verunreinigten Ag möglich
+ Seletion je nach Anforderung
- hohe Herstellkosten
- polyklonale --> spezifischere Diagnostik
Warum waren therapeutische AK der ersten generation am Markt nicht erforderlich?
bad human effector response, tierische AK
Skizzieren Sie den Aufbau eines IgG. Benennen Sie die Domänen. Was bedeuten Beizeichnungen wie Fab, F(ab)2, Fc. Wo bindet das Antigen?
Welche 3 Prinzipien werden genutzt um AK herzustellen. Was sind die Vor- und Nachteile?
- Hybridomazellen
+ kontinuierliche Produktion
- Ineffizient --> Hybridomazelle gelingt nicht immer - Tiere (Immunisierung und Aufreinigung)
- Stammzelle (Differenzierung zur B-Lymphozyte/Plasmazelle)
Vor- und Nachteile von Antikörpern als Wirkstoffe
- Groß: langsame Diffusion, keine intrazelluläre Wirkung, schlechter Zugang zu dichtem (Tumor-)Gewebe
+ verschiedene unabhängige Funktionen: Paratop/Epitop Interaktion, Aktivierung myeloischer Immunzellen über Fc-Rezeptor, Komplementaktivierung
+ selten Funktionsverlust
Wie funktioniert die Seletion? Was ist der Sinn des Boosterns bei der klassischen Immunisierung?
APC präsentiert das Ag auf der Oberfläche --> passende B-Zellen werden selektiert
Beim Boostern --> erneute Ag Präsentation --> verbessert die AK je öfter in Kontakt
Erklären Sie das Prinzip der AC?
Aufreinigung/ Selektion von Anitkörpern/Enzyme durch passende Epitope/Substrate
feste Phase mit Antigen, AK Mischung als flüssige Phase auf die feste Phase bringen, Waschschritt, Elution
Welche Elutionsmodi gibt es in der AC und was sind deren Vor- & Nachteile?
spezifisch:
- Affinitätsmoleküle substituieren (Affinitätsmolekül passt besser zu gebundenem Ligand)
+ Protein mit freier Ligandenbindestelle, sehr schonend & spezifisch
- Verfügbarkeit, Affinitätsmolekül in Proteinprobe, Kosten - Ligandenaustausch (Ligand passt besser zu Affinitätsmolekül)
+ schonend & spezifisch, Verfügbarkeit
- Kosten, Affinitätsmolekül in Proteinprobe, Ligandenbindungsstelle in Protein besetzt
unspezifisch
- Konformationsänderung Wechselionenstärke
+ kostengünstig, Proteinprobe ligandfrei, universell einsetzbar
- Denaturierungsrisiko, Aktivitätsverlust, zum Teil ineffizient - Konformationsänderugn pH Änderung
+ kostengünstig, universell, Proteinproben ligandfrei
- Denaturierungsrisiko/ Aktivitätsverlust, zum Teil ineffizient
Was ist der Unterschied zwischen Gruppenspezifischen und monospezifischen Liganden in der Affinitätschromatographie?
Monospezifisch --> passen nur zu einem Paratop
Gruppenspezifisch --> passen zu mehreren ähnlichen Paratopen (Christof, Christian, Christin)
Weclhe Schritte definiert die Affinitätschromatographie?
- Herstellen der Matrix
- Konditionieren derMatrix
- Beladen mit Probe
- Waschen
- Eluieren
- Regeneration der Matrix
Welche Proteine können mit Protein A/G Affinitätschromatographie aufgereinigt werden? Ist diese AC monospezifisch?
Mit Protein A/G können Antikörper aufgereinigt werden. Binden an Fc Teil, nicht monospezifisch, da Bindung mit allen Fc Teilen
Welche 5 Phasen unterscheidet man während der adaptiven Immunantwort?
- Infektion
- Erkennungs-
- Differenzierungs-
- Wirkungs-
- Abschaltphase
Wie kommt die Variabilität von Antikörpern zustande
- somatische Rekombination
- Gen Rearagement
- Somatische Hypermutation
Was ist die HuCAL Technologie
Human Combinatorial Antibody Library --> Masterbibliothek
Vor und Nachteile von rekombinanten Antikörpern
+ Produktion ohne Tiere in Bakterien
+ Nutzung der E.coli Technologie
+ Produktion von MAK ohne ineffiziente Fuisionsschritte
+ toxische Antigene möglich
- Mutationen müssen in PCR Runden durchgeführt werden
- alles muss in Durchsatz durchgeführt werden
- aufwändige Technologie
Was ist BiTE
Bispezifischer T-Cell
sehr hohe Bindungsaffinität
- bindet mit Paratop an Tumorzelle (schwächere Bindungsaffinität)
- bindet mit Paratop 2 an CD3 Moleküle auf T-Zellen
- Sterische Nähe von Tumorzelle & aktiviertem T-Lymphozyten führt zur Eliminierung der Tumorzelle
Worin unterscheidet sich ein Peptid vom Protein?
Proteine sind aus Peptiden aufgebaut,
Keine klare Abrengung wann ein Peptid ein Protein ist (ab ca. 100 AS), Proteine sind eher linearkettig (Primärstruktur), Proteine bilden eher Sekundäre, Tertiäre und Quartiäre Strukturen aus
Chemisch Struktur einer Peptidbindung zeichnen und erklären warum diese Bindung so stabil ist.
H2O wird abgespalten,
Doppelbindungscharakter zwischen CO und NH
planare Struktur ist sterisch --> optimal für die Delokalisierung von Elektronen
Ausbildung mesomerer Grenzstrukturen
Wie benennt man alpha und beta AS? Was kommt vor?
Von dem COOH C-Atom aus wird gezählt bis dort hin, wo die NH2 Gruppe gebunden ist
Protoinogene AS sind immer alpha
Gibt es bei Peptiden auch Sekundär- Tertiär- Quartiärstrukturen?
Ja, zwischen/innerhalb von Peptidketten können sich genauso ionische, polare und hydrophobe Wechselwirkungen ausbilden
Warum gibt es bei den alpha AS D & L Enantiomere? Welche der 20 protoinogenen AS ist nicht chiral?
Sobald ein chirales C-Atom in einem Molekül vorkommt, gibt es auch Enantiomere, also nicht deckungsgleiche Moleküle (Spiegelbilder)
Glycin ist die einzige AS die kein chirales C-Atom besitzt und damit auch keine Enantiomere ausbilden kann.
Welche AS sind bei pH 7 negativ geladen?
Asp und Glu
Welche AS sind bei pH 7 positiv geladen?
Arg, His, Lys
Welche AS sind hydrophil?
Arg, Asn, Asp, Gly, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr
Zeichnen Sie Alanin bei pH < 7 und pH > 7 an
zugabe Base --> pH > 7
zugabe säure --> pH < 7
Was bedeutet Chiralität?
Chiralität besitzen Moleküle die chirale C-Atome (4 versch. Liganden) besitzen.
Durch die unterschiedliche Anordnung der Liganden am C-Atom können die Moleküle durch keine Bewegung im Raum , sondern nur durch Spiegelung an einer Ebene zur Deckung gebracht werden.
Was sind Enantiomere?
Moleküle mit chiralem C-Atom, deren Ligandenverknüpfung sich unterscheidet und die sich ähneln wie Bild und Spiegelbild
Was ist ein Racemat?
Gemisch aus beiden Enantiomermolekülen
Was ist Stereoisomerie?
Isomere mit derselben Molekülverknüfung (werden in Enantiomere und Diastereomere unterteilt)
Was sind Diastereomere?
keine Spiegelbilder --> zum Beispil cis und trans
Warum ist das unterschiedliche Verhalten von Enantiomeren in chiraler Umgebung gerade für die Pharmaindustrie wichtig?
In einer chrialen Umgebung (Moleküle im Körper) wirken auch chriale Wirtstoffe unterschiedlich.
Im besten Fall ist das unpassene Enantiomer unwirksam, jedoch besitzt ein solches Enantiomer auch oft eine toxische Wirkung.
Was ist ein Helixbrecher?
--> β-verzweigte AS (Val, ILe, Thr => sterisch)
--> H-Brückenbildner Nähe Backbone (Ser, Asp, Asn)
--> Pro & N-alkyl-AS wirken nicht als H-Donor
Fischer Nomenklatur
1) längste C-Kette (mit COOH nach oben) von oben nach unten zeichnen
2) Horizontale Bindungen anpassen
3) wenn Aminogruppe links steht --> L-Form
CIP Nomenklatur
Liganden von C erhalten Platzierung je nach Ordnungszahl (größte = Platz 1)
letzte Platzierung wird nachhinten gedreht
Bei gleichen Liganden wird nächster gezählt, bei Doppelbindungen wird doppelt gezählt und Phantomatome in Klammern gesetzt
Wenn die Platzieungen im Uhzeigersinn aufsteigen --> R-Form, ansonsten S-Form
Was ist der Isoelektrische Punkt?
pH Wert(e) bei dem die Aminosäure in der Bilanz neutral geladen ist (Einzelladungen heben sich auf)
Was bewirkt die Methylierung der Lysine in Histone?
durch die Methylierung ist Lysin weniger stark positiv geladen --> Bindung zur DNA lässt nach --> Regulierung der Genexpression
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Worin unterscheidet sich ein Peptid vom Protein?
Proteine sind aus Peptiden aufgebaut,
Keine klare Abrengung wann ein Peptid ein Protein ist (ab ca. 100 AS), Proteine sind eher linearkettig (Primärstruktur), Proteine bilden eher Sekundäre, Tertiäre und Quartiäre Strukturen aus
Chemisch Struktur einer Peptidbindung zeichnen und erklären warum diese Bindung so stabil ist.
H2O wird abgespalten,
Doppelbindungscharakter zwischen CO und NH
planare Struktur ist sterisch --> optimal für die Delokalisierung von Elektronen
Ausbildung mesomerer Grenzstrukturen
Wie benennt man alpha und beta AS? Was kommt vor?
Von dem COOH C-Atom aus wird gezählt bis dort hin, wo die NH2 Gruppe gebunden ist
Protoinogene AS sind immer alpha
Gibt es bei Peptiden auch Sekundär- Tertiär- Quartiärstrukturen?
Ja, zwischen/innerhalb von Peptidketten können sich genauso ionische, polare und hydrophobe Wechselwirkungen ausbilden
Warum gibt es bei den alpha AS D & L Enantiomere? Welche der 20 protoinogenen AS ist nicht chiral?
Sobald ein chirales C-Atom in einem Molekül vorkommt, gibt es auch Enantiomere, also nicht deckungsgleiche Moleküle (Spiegelbilder)
Glycin ist die einzige AS die kein chirales C-Atom besitzt und damit auch keine Enantiomere ausbilden kann.
Welche AS sind bei pH 7 negativ geladen?
Asp und Glu
Welche AS sind bei pH 7 positiv geladen?
Arg, His, Lys
Welche AS sind hydrophil?
Arg, Asn, Asp, Gly, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr
Zeichnen Sie Alanin bei pH < 7 und pH > 7 an
zugabe Base --> pH > 7
zugabe säure --> pH < 7
Was bedeutet Chiralität?
Chiralität besitzen Moleküle die chirale C-Atome (4 versch. Liganden) besitzen.
Durch die unterschiedliche Anordnung der Liganden am C-Atom können die Moleküle durch keine Bewegung im Raum , sondern nur durch Spiegelung an einer Ebene zur Deckung gebracht werden.
Was sind Enantiomere?
Moleküle mit chiralem C-Atom, deren Ligandenverknüpfung sich unterscheidet und die sich ähneln wie Bild und Spiegelbild
Was ist ein Racemat?
Gemisch aus beiden Enantiomermolekülen
Was ist Stereoisomerie?
Isomere mit derselben Molekülverknüfung (werden in Enantiomere und Diastereomere unterteilt)
Was sind Diastereomere?
keine Spiegelbilder --> zum Beispil cis und trans
Warum ist das unterschiedliche Verhalten von Enantiomeren in chiraler Umgebung gerade für die Pharmaindustrie wichtig?
In einer chrialen Umgebung (Moleküle im Körper) wirken auch chriale Wirtstoffe unterschiedlich.
Im besten Fall ist das unpassene Enantiomer unwirksam, jedoch besitzt ein solches Enantiomer auch oft eine toxische Wirkung.
Was ist ein Helixbrecher?
--> β-verzweigte AS (Val, ILe, Thr => sterisch)
--> H-Brückenbildner Nähe Backbone (Ser, Asp, Asn)
--> Pro & N-alkyl-AS wirken nicht als H-Donor
Fischer Nomenklatur
1) längste C-Kette (mit COOH nach oben) von oben nach unten zeichnen
2) Horizontale Bindungen anpassen
3) wenn Aminogruppe links steht --> L-Form
CIP Nomenklatur
Liganden von C erhalten Platzierung je nach Ordnungszahl (größte = Platz 1)
letzte Platzierung wird nachhinten gedreht
Bei gleichen Liganden wird nächster gezählt, bei Doppelbindungen wird doppelt gezählt und Phantomatome in Klammern gesetzt
Wenn die Platzieungen im Uhzeigersinn aufsteigen --> R-Form, ansonsten S-Form
Was ist der Isoelektrische Punkt?
pH Wert(e) bei dem die Aminosäure in der Bilanz neutral geladen ist (Einzelladungen heben sich auf)
Was bewirkt die Methylierung der Lysine in Histone?
durch die Methylierung ist Lysin weniger stark positiv geladen --> Bindung zur DNA lässt nach --> Regulierung der Genexpression
Wie kann die Bindung von Histonen zur DNA gelöst werden?
Durch Acetylierung wird das Lysin in den Histonen vom positiv geladenen Zustand neutral --> löst sich von der negativ geladenen DNA
Welche Strukturen sind wichtig für die Sekundärstruktur?
α-Helix, β-Faltblatt, Stabilisierung durch Wasserstoffbrückenbindungen
Was ist das Helical Wheel?
Darstellung der räumlichen Ausrichtung von Seitenketten in Helices
Identifizierung von hydrophoben/hydrophilen Oberflächenregionen und von räumlichen Bindungsmotiven (Leucin Zipper)
Was ist der Leucin Zipper?
Motiv aller Transkriptionsfaktoren
Wichtig für stabile Dimerbildung der DNA bindenden Proteine
Wie kommt ein β-Faltblatt zustande?
parallel: 1 AS macht 2 Brücken zu 2 AS
N --> C
-->
antiparallel: 1 AS macht 2 Brücken zu 1 AS
N --> C
C <-- N
Bindungen entstehen zwischen den = O und den H der N
Welche felxiblen Zwischenstrukturen gibt es und wofür sind sie geeignet?
Zur Tertiärstrukturbildung
β-Turn, Kehre, reverse, hairpin (enger)
Schleife, Loops (weiter)
Bindungen: hydrophobe WW, H-Brücken und Disulfidbrücken
Wodurch erlangen Peptide ihre Funktion?
1) lineare Primärsequenzen --> funktionale 3D Struktur zur Energieminimierung
2) Vielfalt der funktionalen Gruppen
3) Jedes Protein --> viele Interaktionsmöglichkeiten (DNA-Replikation, Zell-Signalling,...)
4) Unterschiedliche Strukturelemente = starre und flexible Makromoleküle für unterschiedliche Aufgaben
Nomenklatur von linearen Peptiden
1) Anzahl der Aminosäuren
2) N-Term zuerst (immer links)
Bezeichnung aller AS als ...ly bis auf die letzte
Bei 1/3-BuchstabenCode: H-AS-AS-AS-OH
Wie werden die D-AS in der Nomenklatur dargestellt?
Wie werden Cyclopeptide dargestellt?
val oder D-Val
cyclo-(-AS-AS-AS-)
Wie nennt man Disulfidbrücken innerhalb der selben Kette und wie zwischen Ketten?
innerhalb: Intramolekulare Disulfidbrücken
zwischen: intermolekulare
Was sind Peptidbibliotheken?
Peptide der selben Sequenzlänge mit verschiedenen AS in einer oder mehreren Sequenzpositionen, können als Gemisch aller Peptide in Form einer Bibliothek dargestellt werden
Was sind Peptidanaloga?
Peptidbindung die durch andere Bindung ersetzt werden kann
Schreibweise ...- ψ[alternative Bindung]-...
Was sind die Unterschiede in der natürlichen und der chemischen Peptidsynthese
natürliche Peptidchemie
Bausteine AS+tRNA geschützte AS
Bauplan DNA > RNA Idee/Auftrag/Computer
Durch. Start bei N-Term Start bei C-Term
Einbau einzelner AS Einbau einzelner AS Freisetzung von Ribo Absp. Träger & Schutzgr.
Faltung (Chaperone),PTM Zufällige Faltung,OQ
Nutzung Molekulare Maschine Forschung, Therapeutikum
Was sind Polymere? Nennen Sie Beispiele.
Polymere sind Verbindungen die durch Addition oder Kondensation gleicher Moleküle gebildet werden.
Biopolymere sind Polypeptidketten, Nukleinsäure, Zellulose, Glykogen.
Synthetische Polymere sind Polystyrol, Polyethylen, Polyethykenglykol
Nennen Sie die 4 wichtigsten Schritte der chemischen Peptidsynthese. Welche Schritte werden zum Aufabu einer Peptidsynthese beim Einbau jeden neuen Bausteins wiederholt?
1) Bereitstellen der Schutzgruppen (temporäre und permanente),
2) Kopplung der Bausteine --> Aufreinigen des Kopplungsprodukts
3) lösen der temporären Schutzgruppe (ggf. Aufreinigen des Kopplungsprodukts)
4) Nach vollständiger Synthese --> Entfernen der permanenten Schutzgruppen an den Seitenketten und C-Terminus
Die Schritte 2) und 3) werden wiederholt
Worin unterscheiden sich die klassische Peptidsynthese in Lösung und die Festphasensynthese?
Bei der Lösungssynthese ist nach jeder Kopplung ein Aufreinigungsschritt durch Kristallisation nötig, bei der Festphase (= filtrierbares Peptidkügelchen) ist der C-Terminus durch die Festphase als Schutzgruppe geschützt --> hier kann eine einfache Filtration durchgeführt werden. Daher ist die Festphasen-Synthese eine sehr viel schnellere Methode als die Lösungssynthese.
Nennen Sie Vor und Nachteile von Lösungs- und Festphasensynthese
Lösung
+ mit klassischer Ausrüstung
+ Zwischenprodukte werden gereinigt
- langsame Zyklen
- schlecht automatisierbar
- arbeitsintensiv und teuer
Festphasen
+ schnelle Zyklen
+ Reagenzien in hohem Überschuss einsetzbar
+ einfach automatisierbar, parallelisierbar
- ungereinigte Zwischenprodukte
- heterogenes Endprodukt/komplexe Aufreinigung
Was bedeutet orthogonale Schutzgruppen-Strategie? Nennen Sie ein Beispiel.
Die Reaktionsbedingungen zur Abspaltung einer temporären Schutzgruppe beeinflussen die permanenten Schutzgruppen nicht.
--> Die Schutzgruppen lassen sich spezifisch abspalten
Beispiel:
Fmoc als Temporäre Schutzgruppe
Benzylester an C-Terminus und je nach Seitenkette mit tert-Benzylester als permanente Schutzgruppe geschützt sein
Abspaltung: Fmoc mit Piperidin, Benzylester mit Säure (Triflouressigsäure)
Rekombinante Herstellungsstrategien von Proteinen und Peptiden sind heute Routineprozesse. Warum wird dann heute trotzdem noch Peptidsynthese gemacht und warum erlebt sie in den letzte Jahren sogar eine Renaissance?
Chem Peptidsynthese
- Versuch Peptide können räumlich angeordnet werden
- kann jede as/label/Farbstoff einbauen
Proteine werden schon lange als Medikamenten eingesetzt.
Seit einigen Jahren wird an Antikörper-Therapeutika geforscht (auch in der Krebsforschung)
Optimierung von pharmazeutischen Peptidwirkstoffen & neue Drugs
Biologische Funktionsstudien
Warum werden in der Naturstoffsynthese Schutzgruppen verwendet? Vergleichen Sie das Schutzgruppenkonzept der chemischen Peptidsynthese mit der PBS einer Zelle. Gibt es in der Natur auch permanente & temporäre Schutzgruppen & Kopplungsreagenzien?
Ohne die Verwendung von Schutzgruppen entstehen viele ungewollte Nebenprodukte (teuer, Aufreinigung, Zeit), daher müssen mögliche aber ungewollte Reaktionspartner geschützt werden.
Bei der PBS stellt die Organisation der Ribosome sicher, dass die AS an der richtigen Stelle verknüpft werden (vgl. Schutzgruppen)
