Biological Engineering
Biological Engineering, BMS, HS albsig
Biological Engineering, BMS, HS albsig
Was sind Aptamere?
DNA/RNA katalytisch aktiv durch 3D Struktur (Rückfaltung)
Erklären Sie das SELEX Prinzip zur Hestellung von Aptameren.
Aptamerbibliothek wird gegen Antigen gescreent, passende Aptamere werden amplifiziert --> ein Teil davon wird mutiert --> erneuter Durchgang --> screening um evtl. noch besseren Treffer zu erreichen
Nennen Sie die verschiedenen aktuell genutzten Haupttypen von Bindemolekülen (Scaffolds)
- AK Ähnliche (AK Fragmente)
- AK (MAK&PAK)
- andere Protein Scaffolds (Proteinbindemoleküle)
- Non-Protein Scaffolds (Aptamere)
- chemische Scaffolds (molekulares Imprinting)
Erklären Sie das immunologische Grundprinzip der Antikörperentstehuung in Säugetieren
T-Helferzellen (CD4+) durch APC aktiviert --> B-Zelle --> Antigen-bindender B-Zellenklon teilt sich nach Aktivierung --> (klonale Selektion) --> Aktivierte B-Zelle wird Plasmazelle --> Sekretiert Antikörper
Vorteile und Nachteile von MAK
+ gut etabliertr Produktion
+ nicht Patentgeschützt
+ auch mit verunreinigten Ag möglich
+ Seletion je nach Anforderung
- hohe Herstellkosten
- polyklonale --> spezifischere Diagnostik
Warum waren therapeutische AK der ersten generation am Markt nicht erforderlich?
bad human effector response, tierische AK
Skizzieren Sie den Aufbau eines IgG. Benennen Sie die Domänen. Was bedeuten Beizeichnungen wie Fab, F(ab)2, Fc. Wo bindet das Antigen?
Welche 3 Prinzipien werden genutzt um AK herzustellen. Was sind die Vor- und Nachteile?
- Hybridomazellen
+ kontinuierliche Produktion
- Ineffizient --> Hybridomazelle gelingt nicht immer - Tiere (Immunisierung und Aufreinigung)
- Stammzelle (Differenzierung zur B-Lymphozyte/Plasmazelle)
Vor- und Nachteile von Antikörpern als Wirkstoffe
- Groß: langsame Diffusion, keine intrazelluläre Wirkung, schlechter Zugang zu dichtem (Tumor-)Gewebe
+ verschiedene unabhängige Funktionen: Paratop/Epitop Interaktion, Aktivierung myeloischer Immunzellen über Fc-Rezeptor, Komplementaktivierung
+ selten Funktionsverlust
Wie funktioniert die Seletion? Was ist der Sinn des Boosterns bei der klassischen Immunisierung?
APC präsentiert das Ag auf der Oberfläche --> passende B-Zellen werden selektiert
Beim Boostern --> erneute Ag Präsentation --> verbessert die AK je öfter in Kontakt
Erklären Sie das Prinzip der AC?
Aufreinigung/ Selektion von Anitkörpern/Enzyme durch passende Epitope/Substrate
feste Phase mit Antigen, AK Mischung als flüssige Phase auf die feste Phase bringen, Waschschritt, Elution
Welche Elutionsmodi gibt es in der AC und was sind deren Vor- & Nachteile?
spezifisch:
- Affinitätsmoleküle substituieren (Affinitätsmolekül passt besser zu gebundenem Ligand)
+ Protein mit freier Ligandenbindestelle, sehr schonend & spezifisch
- Verfügbarkeit, Affinitätsmolekül in Proteinprobe, Kosten - Ligandenaustausch (Ligand passt besser zu Affinitätsmolekül)
+ schonend & spezifisch, Verfügbarkeit
- Kosten, Affinitätsmolekül in Proteinprobe, Ligandenbindungsstelle in Protein besetzt
unspezifisch
- Konformationsänderung Wechselionenstärke
+ kostengünstig, Proteinprobe ligandfrei, universell einsetzbar
- Denaturierungsrisiko, Aktivitätsverlust, zum Teil ineffizient - Konformationsänderugn pH Änderung
+ kostengünstig, universell, Proteinproben ligandfrei
- Denaturierungsrisiko/ Aktivitätsverlust, zum Teil ineffizient
Was ist der Unterschied zwischen Gruppenspezifischen und monospezifischen Liganden in der Affinitätschromatographie?
Monospezifisch --> passen nur zu einem Paratop
Gruppenspezifisch --> passen zu mehreren ähnlichen Paratopen (Christof, Christian, Christin)
Weclhe Schritte definiert die Affinitätschromatographie?
- Herstellen der Matrix
- Konditionieren derMatrix
- Beladen mit Probe
- Waschen
- Eluieren
- Regeneration der Matrix
Welche Proteine können mit Protein A/G Affinitätschromatographie aufgereinigt werden? Ist diese AC monospezifisch?
Mit Protein A/G können Antikörper aufgereinigt werden. Binden an Fc Teil, nicht monospezifisch, da Bindung mit allen Fc Teilen
Welche 5 Phasen unterscheidet man während der adaptiven Immunantwort?
- Infektion
- Erkennungs-
- Differenzierungs-
- Wirkungs-
- Abschaltphase
Wie kommt die Variabilität von Antikörpern zustande
- somatische Rekombination
- Gen Rearagement
- Somatische Hypermutation
Was ist die HuCAL Technologie
Human Combinatorial Antibody Library --> Masterbibliothek
Vor und Nachteile von rekombinanten Antikörpern
+ Produktion ohne Tiere in Bakterien
+ Nutzung der E.coli Technologie
+ Produktion von MAK ohne ineffiziente Fuisionsschritte
+ toxische Antigene möglich
- Mutationen müssen in PCR Runden durchgeführt werden
- alles muss in Durchsatz durchgeführt werden
- aufwändige Technologie
Was ist BiTE
Bispezifischer T-Cell
sehr hohe Bindungsaffinität
- bindet mit Paratop an Tumorzelle (schwächere Bindungsaffinität)
- bindet mit Paratop 2 an CD3 Moleküle auf T-Zellen
- Sterische Nähe von Tumorzelle & aktiviertem T-Lymphozyten führt zur Eliminierung der Tumorzelle
Worin unterscheidet sich ein Peptid vom Protein?
Proteine sind aus Peptiden aufgebaut,
Keine klare Abrengung wann ein Peptid ein Protein ist (ab ca. 100 AS), Proteine sind eher linearkettig (Primärstruktur), Proteine bilden eher Sekundäre, Tertiäre und Quartiäre Strukturen aus
Chemisch Struktur einer Peptidbindung zeichnen und erklären warum diese Bindung so stabil ist.
H2O wird abgespalten,
Doppelbindungscharakter zwischen CO und NH
planare Struktur ist sterisch --> optimal für die Delokalisierung von Elektronen
Ausbildung mesomerer Grenzstrukturen
Wie benennt man alpha und beta AS? Was kommt vor?
Von dem COOH C-Atom aus wird gezählt bis dort hin, wo die NH2 Gruppe gebunden ist
Protoinogene AS sind immer alpha
Gibt es bei Peptiden auch Sekundär- Tertiär- Quartiärstrukturen?
Ja, zwischen/innerhalb von Peptidketten können sich genauso ionische, polare und hydrophobe Wechselwirkungen ausbilden
Warum gibt es bei den alpha AS D & L Enantiomere? Welche der 20 protoinogenen AS ist nicht chiral?
Sobald ein chirales C-Atom in einem Molekül vorkommt, gibt es auch Enantiomere, also nicht deckungsgleiche Moleküle (Spiegelbilder)
Glycin ist die einzige AS die kein chirales C-Atom besitzt und damit auch keine Enantiomere ausbilden kann.
Welche AS sind bei pH 7 negativ geladen?
Asp und Glu
Welche AS sind bei pH 7 positiv geladen?
Arg, His, Lys
Welche AS sind hydrophil?
Arg, Asn, Asp, Gly, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr
Zeichnen Sie Alanin bei pH < 7 und pH > 7 an
zugabe Base --> pH > 7
zugabe säure --> pH < 7
Was bedeutet Chiralität?
Chiralität besitzen Moleküle die chirale C-Atome (4 versch. Liganden) besitzen.
Durch die unterschiedliche Anordnung der Liganden am C-Atom können die Moleküle durch keine Bewegung im Raum , sondern nur durch Spiegelung an einer Ebene zur Deckung gebracht werden.
Was sind Enantiomere?
Moleküle mit chiralem C-Atom, deren Ligandenverknüpfung sich unterscheidet und die sich ähneln wie Bild und Spiegelbild
Was ist ein Racemat?
Gemisch aus beiden Enantiomermolekülen
Was ist Stereoisomerie?
Isomere mit derselben Molekülverknüfung (werden in Enantiomere und Diastereomere unterteilt)
Was sind Diastereomere?
keine Spiegelbilder --> zum Beispil cis und trans
Warum ist das unterschiedliche Verhalten von Enantiomeren in chiraler Umgebung gerade für die Pharmaindustrie wichtig?
In einer chrialen Umgebung (Moleküle im Körper) wirken auch chriale Wirtstoffe unterschiedlich.
Im besten Fall ist das unpassene Enantiomer unwirksam, jedoch besitzt ein solches Enantiomer auch oft eine toxische Wirkung.
Was ist ein Helixbrecher?
--> β-verzweigte AS (Val, ILe, Thr => sterisch)
--> H-Brückenbildner Nähe Backbone (Ser, Asp, Asn)
--> Pro & N-alkyl-AS wirken nicht als H-Donor
Fischer Nomenklatur
1) längste C-Kette (mit COOH nach oben) von oben nach unten zeichnen
2) Horizontale Bindungen anpassen
3) wenn Aminogruppe links steht --> L-Form
CIP Nomenklatur
Liganden von C erhalten Platzierung je nach Ordnungszahl (größte = Platz 1)
letzte Platzierung wird nachhinten gedreht
Bei gleichen Liganden wird nächster gezählt, bei Doppelbindungen wird doppelt gezählt und Phantomatome in Klammern gesetzt
Wenn die Platzieungen im Uhzeigersinn aufsteigen --> R-Form, ansonsten S-Form
Was ist der Isoelektrische Punkt?
pH Wert(e) bei dem die Aminosäure in der Bilanz neutral geladen ist (Einzelladungen heben sich auf)
Was bewirkt die Methylierung der Lysine in Histone?
durch die Methylierung ist Lysin weniger stark positiv geladen --> Bindung zur DNA lässt nach --> Regulierung der Genexpression
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Cartes-fiches
Aus welchen Biopolymerklassen sind Ribozyme aufgebaut? Welche Molekülklasse ist katalytisch aktiv? Welche wenigen Reaktionen katalysieren Ribozyme?
Aus Ribonukleotiden, zum Beispiel Spliceosom der mRNA
Ribozyme --> binden spezifisch an Zielmoleküle und katalysieren enzymatische Reaktionen, RNA ist katalytisch aktiv
Was spricht dafür, dass ein Ribozym nicht als Katalysator bezeichnet werden kann? Welche Bezeichnung wird deshalb alternativ verwendet?
Gegen die Bezeichnung Katalysatoren spricht, dass sich die Konformation der Ribozyme irreversibel mit der Reaktion ändert --> im Gegensatz zu Enzymatischen Katalysatoren
Das Ribozym zerschneidet sich in Anwesenheit seines Metabolits selbst --> Daher auch Riboswitch (regulatorischer Riboschalter) genannt
Gibt es neben dem Splicing durch Spliceosom auch autokatalytisches RNA Splicing?
Ja, zum Beispiel Gruppe II-Intron --> Spalten RNA autokatalytisch, wenn physiologische Umgebung bestimmte Werte erreichten ergibt sich eine enge räumliche Nachbarschaft der Exons + 2´-OH-Adenyl in Intron --> 2x Umesterung
Ansonsten noch Gruppe I-Introns --> in Mitochondrien von Pilzen und Pflanzen
Worin besteht der Unterschied in der Zusammensetzung & im Aufbau der Ribosomen von Pro- und Eukaryoten? Welche Moleküle sind die eigentlichen Proteinsynthesizer?
Eukaryoten:
- 80 S Ribosome, 60 S und 40 S UE
- Im Cytoplasma, Mitochondrien, Chlororplasten
Prokaryoten
- 70 S Ribosome, 50 S und 30 S UE
- Im Cytoplasma
Proteinsynthesizer ist Ribosom
Wieviele Domänen besitzen Enzymeinheiten zum Einbau einer AS in nichtribosomalen Peptidylsynthetasen (NRPS)?
Welche Aufgaben haben diese Domänen im Multiple Carrier Modell der NRPS?
A-Domäne: Adenylierungsdomäne - Selektion der Aminosäuren (A-Domänen für 300 verschiedene Substrate bekannt!) --> gate keeper - Code für Spezifität von A Domäne - genom mining, ATP abhängige Aktivierung der Aminosäure --> AMP Ester + PPi
T-Domäne: PCR - Thiolierungsdomäne oder Peptidylcarrierprotein, PTM mit 4´Phosphopantetheinylrest (4-Ppant), WW mit verschiedenen Partnerdomänen zu definierten Zeitpunkten
C-Domäne: Condensationsdomäne - meist am Start eines NRPS Moduls, katalysiert Bildung der neuen Peptidbindung zwischen benachtbarten T gebundenden Substraten, Modellannahme: 2 verschiedene katalytische Binderegionen,
acceptorsite: bindet neue AS der eigenen T-Domäne
donorsite:bindet Teilpeptid der T-Domäne des vorhergehenden Moduls
Te-Domäne: Thioesterasedomäne - oft am Ende einer NRPS Kaskade (C-Terminus des Synthesepeptids), direkte Freisetzung oder Zyklisierungdes Substratpeptides
E-Domäne: Epimerisierungsdomäne - generiert D-AS aus L-AS
Wie viele und welche Subtrate haben autokatalytische RNAs?
Als Substrat nur sich selbst (also eins)
Wie kann der Thioester, der bei der Cystein-Methode am C-Terminus benötigt wird um toxische oder spezifisch modifizierte Proteine herzustellen, hergestellt werden?
- Klonierung einer Proteinsequenz in einen Expressionsvektor mit Inteinsequenz
- Protein wird als N-terminales Extein exprimiert
- Kein C-terminales Extein (kein H, C) --> keine Ligation der Exteine möglich
- N--> S-Acyltransfer findet statt --> stabiler Thioester
- Thioester kann durch Behandlung mit nukleiophil (Thiolreagenz) freigesetzt werden
Vergleichen Sie RNA vs. Protein Splicing
RNA Protein
Intron-Extron Intein-Extein
Spliceosom & autokatalytisch auokatalytisch
Variabilität auf mRNA Ebene PTM
--> translationale Proteinvariabilität --> Proteinvariabilität
Was ist die Expressed Protein Ligation EPL?
Ein Protein-Splicing Mechanismus
Durch Thiolgruppe induziertes Splicing
Anwendung zum Beispiel: - zwei nichttoxische rekombinante Proteinfragmente eines zelltoxischen Proteins
Nennen Sie ein Beispiel wie das Splicing in der Antibiotischen Therapie eingesetzt werden kann.
Bei Mycobakterium tuberculosis --> Hemmen des Splicing-Vorgangs von 2, für das Bakterium, lebenswichtigen Proteinen.
Was ist die NRPS?
Nicht-Ribosomale Proteinsynthese
Enzyme, die unter Einfluss von RNasen und Ribosom-Inhibitoren Proteine synthetisieren können.
Mindestens 3 katalytische Domänen dienen als NRPS
1) Adenylierung der AS (ATP -> AMP)
2) Bildung des Aminoacylthioester (Anhängen von SH, wobei AMP abgeht)
3) Bildung neuer Peptidbindung (NH2 reagiert mit SH an C-Terminus)
4) Ende der gesamten NRPS Kaskade, Abspaltung des fertigen Peptids oft als Cyclopeptid
Benennen Sie die Arbeitsfelder der Biotechnologie.
rot: Medikamente/Therapeutika
grün: Pflanzenschutz
weiß: industriell
grau: Umwelt
blau: Meeresorganismen
geld: Lebensmittel und Grundstoffherstellung
Welche Systeme und Verfahren werden in der Biotech. eingesetzt?
- Bakterien/Zellen
- Enzyme, RNA, DNA, Ribosome,..
- Fermentatoren
- Nährmedium
- Wissenschaftsgebiete wie: Genetik, Zellbiologie, Mikrobiologie, Thermodynamik, Verfahrenstechnik
Was sind historische, biotechnologische Produkte?
Salpeterproduktion, Bier, Essig
Wie lautet die moderne Definition von Antibiotika? Sind Sulfonamide, Natriumazid und H2O2 Antibiotika?
Jedes chemotherapeutische oder antibakterielle Mittel , das auch bei hoher Verdünnung eine Aktivität gegen MO´s zeigt.
In Abgrenzung zu Antiseptika: natürlich gebildet (Bakterien oder Pilze)
Ja, nein, nein
Wie ist die Klassifizierung von Antibiotika nach bakterizid und bakteriostatisch definiert?
Bakteriostatisch --> Verhinderung der Vermehrung von Bakterien
Bakteriozid --> Abtöten von Bakterien
Nennen Sie 5 klassische Targets von heutigen Antibiotika
- Zellwandsynthese
- DNA/RNA Synthese
- Proteinsynthese
- Folatsynthese
- Depolarisation
Nennen Sie die 3 wichtigen Mechanismen der Antibiotikaresistenz, wie werden Resistenzgene zwischen Bakterien ausgetauscht?
- Targetveränderung
- Wirkstoffabbau
- Metabolischer Bypass
- reduzierte Antibiotikaaufnahme
- erhöhter Antibiotikaefflux
--> Resistenzgen auf Plasmid wird vertikal (durch Konjugation, Transduktion, Transformation) oder horizontal (durch Vererbung) weitergegeben
Nennen Sie 3 prinzipiell mögliche Quellen für neue Antibiotika & begründen Sie in einem Satz Ihre Einschätzung für die erwartete Erfolgsrate & den erwarteten Aufwand.
1) Chemische Synthese: mächtiges & einfaches Tool, aber selten Hits
2) Synthese aus antibiotischen Naturstoffen: modifizieren von Naturstoffen --> gleiches Target --> gute Chancen
3) Isolation neuer antibiotischer Naturstoffe: schwer und Zufallsfund
Wie wirkt Penicillin auf molekularer Ebene? Warum wirkt Penicillin nur bei teilenden Bakterien & warum viele u. a. nur bei gram +?
Penicillin bindet die Transpeptidase, die für die Quervernetzung der Peptidoglykanschicht während der Zellwandsynthese ist --> gestörte Zellwandsynthese durch Penicillin --> osmotischer Druck --> Zelle platzt --> nur bei teilenden Zellen der Fall
Da Gramnegative Bakterien im Gegensatz zu Grampositiven Bakterien eine nur sehr dünne Peptidoglykanschicht besitzen wirkt Penicillin überwiegend nur bei Grampositiven.
Warum ist Penicillin für Säuger gesundheitlich unschädlich?
Zellen von Säugern besitzen keine Zellwand
Wodurch konnte die Entiwcklung von Penicillin vorangetrieben werden?
Kontinuierliche Fermentation
verbesseres Down-Streaming
optimierung von Pilzstämmen und Medien
Welcher Resistenzmechanismus führt dazu, dass Penicilline unwirksam werden? Wie wurden Penicilline optimiert, um solche Resistenzen zu umgehen?
Welchem der 5 generellen Resistenzmechanismen ist diese Reaktion zuzurechnen?
1) Spaltung des ß-Lactam-Rings --> Wirkstoffabbau
2) Modifizierte Transpeptidase (Baut Penicillin nicht ein) --> metabolischer Bypass
Was sind MRSA? Welche Antibiotika galten lange als Reserveantibiotika zur Behandlung von MRSA?
Methicillin-resistenter-Staphylococcus Aureus
Vancomycin --> seit 2002 auch Resistenz
Wie unterscheiden sich Vancomycin und Penicillin in Ihrem Wirkmechanismus?
Vancomycin: sterische Hinderung des Angriffs der Transpeptidase --> keine Peptidverknüpfung
Penicillin: reagiert mit aktivem Zentrum der Transpeptidase --> keine Peptidverknüpfung
Wie umgehen Vancomycin-resistente Bakterien den Wirkmechanismus?
Gen vanA --> Umbau der Zellwand in eine mit Vancomycin inkompatible Form (Metabolischer Bypass)
Vergleichen Sie die Prinzipien der antibiotischen Mechanismen der Hemmung der RNA Synthese am Beispiel deas Rifampicin und des Aktinomycin
Rifampicin --> blockiert mRNA- Austrittskanal der bakteriellen RNA-Polymerase (keine mRNA -> keine Proteine) - bakterizid
--> Resistenz durch Targetmodifikation
Aktinomycin --> wirkt interkalierend auf die DNA, steht nicht mehr zur mRNA Synthese zur Verfügung --> keine mRNA - bakteriostatisch
--> Resistenz durch modifizierte Zellmembran
Begründen Sie warum die Folat-, Zellwand- & Proteinbiosynthese für die Entwicklung von Antibiotika optimale Targetstrukturen bilden.
Bakterienspezifische Targets mit vielen Möglichkeiten (Wirkstoffmodifizierung)
Trotz gut etablierter & zuverlässiger Nachweisverfahren werden in ca. 40-60 % bakterieller Infektionen unwirksame Antibiotika verordnet. Was könnte der Grund dafür sein?
Oft werden Breitbandantibiotika eingesetzt, in der Hoffnung es trifft den Keim.
Diagnostik/serotypisierung teuer und zeitaufwändig
Welche Schritte werden durch die Antibiotika Tetracyclin, Erythromycin, Chloramphenicol Fusidinsäure geblockt?
Tetracyclin --> blockiert Anlagerung der tRNA am 30S Ribosom
Chloramphenicol --> blockiert Peptidyltransferzentrum aus 50 S UE
Erythromycin --> blockiert Translokation der tRNA auf 50S UE
Fusidinsäure --> Elongationsfaktor und verhindert dadurch die Proteinbiosynthese am bakteriellen Ribosom
Was sind die Schwachpunkte bei Penicillin?
1) säurelabiles Molekül --> semisynthetische Stabilisierung gegen Säure
2) schlechte Pharmakokinetik (HWZ, schlechte Absorption) --> Prodrug
3) ß-Lactamase deaktiviert ß-Lactamring (schnelle Resistenzentwicklung) --> zum Beispiel Methicillin stabil durch sterische Hinderung
Wie wirkt Vancomycin?
Reserveantibiotika - hemmt die Zellwandsynthese --> sterische Hinderung des Angriffs der Transpeptidase
Nennen Sie die 6 Angriffspunkte und jeweils ein Beispiel
- Zellwandsynthese (Penicillin, Methicillin, Vancomycin)
- DNA/RNA Synthese (Rifampicin, Actinomycin D)
- Proteinbiosynthese (Trtracyclin, Chloramphenicol, Erythromycin, Fusidinsäure)
- Folatsynthese
- Depolarisation (Gramicidin--> Baut sich in Zellwand ein und bildet ähnlcih wie Defensine Pore)
Was sind Konjugation, Transfromation und Transduktion?
vertikale Gentransfers
- Konjugation: Plasmidübertragung zwischen Bakterien
- Transduktion: über Phagen
- Transformation: Aufnahme von Plasmiden toter Bakterien
Nennen Sie die Problematik der Antibiotika-Therapie in Zusammenhang mit den humanen Mitochondrien.
Endosymbiontentheorie; Mitochondrien waren Bakterien die sich in Eukaryoten eingenistet haben
--> Antibiotika zielen auf bakterielle Strukturen ab --> Mitochondrien werden geschädigt
Zum Beispiel: Aminoglycosid --> Blockiert Bindung der tRNA --> aber auch Hemmung mitochondrialer Ribosomen in Eukaryoten --> Gehörschäden
Welche Produzenten für klassische AK kennen Sie? Englisch & Deutsch
B-Zellen --> Plasmazellen
Mouse/Maus, Goat/Ziege, Rabbit/Kaninchen, Rat/Ratte, Donkey/Esel
Warum können Seren nicht direkt in Assays eingesetzt werden? Wie klnnen Seren für die Verwendung in der Diagnostik oder in Assays aufbereitet werden?
- Störfaktoren, Verunreinigungen
- viele verschiedene AK --> Aufreinigung durch Affinitätschromatographie
Welche vier Mechanismen führen zu hoher Vatriabilität der AK?
- mehrere Kopien derselben Genabschnitte können Kombiniert werden
- variable Domäne von schwerer und leichter Kette können kombiniert werden
- ungenaue Rekombination der Gensegmente
- somatische Hypermutation --> Affinitätsreinigung
Erklären Sie das prinzipielle Vorgehen bei der Herstellung von MAK
Hybridomazelle:
Immunisierte Maus --> Extraktion der Milz --> Entnahme der B-Zellen --> Fusion mit Tumorzelle --> Screening (ELISA) --> Zellkulturüberstand --> keine Affinitätschromatographie nötig, da durch ELISA schon selektiert
Beschreiben Sie die prinzipiellen Schritte zur Generierung einer Phagenbibliothek zur scFv Herstellung. Was heißt scFv? Was sind Vorteile gegenüber MAK?
Erstellen einer Phagenbib.:
- mRNA ohne Introns --> reverse Transkriptase --> cDNA --> PCR von H-Ketten-cDNA und L-Ketten-cDNA --> Einbau von H- und L-Ketten (zufällige Kombinantion) in einen Expressionsvektor --> Verpackung in lambda-Phage --> kombinatorische Phagenbibliothek
scFv --> single chain Fragment variable --> besteht nur aus Paratop
Vorteil: kleiner, leichtere Diffusion, vor allem auch in dichteres Tumorgewebe, leichter und schneller herzustellen
