Biological Engineering
Biological Engineering, BMS, HS albsig
Biological Engineering, BMS, HS albsig
Was sind Aptamere?
DNA/RNA katalytisch aktiv durch 3D Struktur (Rückfaltung)
Erklären Sie das SELEX Prinzip zur Hestellung von Aptameren.
Aptamerbibliothek wird gegen Antigen gescreent, passende Aptamere werden amplifiziert --> ein Teil davon wird mutiert --> erneuter Durchgang --> screening um evtl. noch besseren Treffer zu erreichen
Nennen Sie die verschiedenen aktuell genutzten Haupttypen von Bindemolekülen (Scaffolds)
- AK Ähnliche (AK Fragmente)
- AK (MAK&PAK)
- andere Protein Scaffolds (Proteinbindemoleküle)
- Non-Protein Scaffolds (Aptamere)
- chemische Scaffolds (molekulares Imprinting)
Erklären Sie das immunologische Grundprinzip der Antikörperentstehuung in Säugetieren
T-Helferzellen (CD4+) durch APC aktiviert --> B-Zelle --> Antigen-bindender B-Zellenklon teilt sich nach Aktivierung --> (klonale Selektion) --> Aktivierte B-Zelle wird Plasmazelle --> Sekretiert Antikörper
Vorteile und Nachteile von MAK
+ gut etabliertr Produktion
+ nicht Patentgeschützt
+ auch mit verunreinigten Ag möglich
+ Seletion je nach Anforderung
- hohe Herstellkosten
- polyklonale --> spezifischere Diagnostik
Warum waren therapeutische AK der ersten generation am Markt nicht erforderlich?
bad human effector response, tierische AK
Skizzieren Sie den Aufbau eines IgG. Benennen Sie die Domänen. Was bedeuten Beizeichnungen wie Fab, F(ab)2, Fc. Wo bindet das Antigen?
Welche 3 Prinzipien werden genutzt um AK herzustellen. Was sind die Vor- und Nachteile?
- Hybridomazellen
+ kontinuierliche Produktion
- Ineffizient --> Hybridomazelle gelingt nicht immer - Tiere (Immunisierung und Aufreinigung)
- Stammzelle (Differenzierung zur B-Lymphozyte/Plasmazelle)
Vor- und Nachteile von Antikörpern als Wirkstoffe
- Groß: langsame Diffusion, keine intrazelluläre Wirkung, schlechter Zugang zu dichtem (Tumor-)Gewebe
+ verschiedene unabhängige Funktionen: Paratop/Epitop Interaktion, Aktivierung myeloischer Immunzellen über Fc-Rezeptor, Komplementaktivierung
+ selten Funktionsverlust
Wie funktioniert die Seletion? Was ist der Sinn des Boosterns bei der klassischen Immunisierung?
APC präsentiert das Ag auf der Oberfläche --> passende B-Zellen werden selektiert
Beim Boostern --> erneute Ag Präsentation --> verbessert die AK je öfter in Kontakt
Erklären Sie das Prinzip der AC?
Aufreinigung/ Selektion von Anitkörpern/Enzyme durch passende Epitope/Substrate
feste Phase mit Antigen, AK Mischung als flüssige Phase auf die feste Phase bringen, Waschschritt, Elution
Welche Elutionsmodi gibt es in der AC und was sind deren Vor- & Nachteile?
spezifisch:
- Affinitätsmoleküle substituieren (Affinitätsmolekül passt besser zu gebundenem Ligand)
+ Protein mit freier Ligandenbindestelle, sehr schonend & spezifisch
- Verfügbarkeit, Affinitätsmolekül in Proteinprobe, Kosten - Ligandenaustausch (Ligand passt besser zu Affinitätsmolekül)
+ schonend & spezifisch, Verfügbarkeit
- Kosten, Affinitätsmolekül in Proteinprobe, Ligandenbindungsstelle in Protein besetzt
unspezifisch
- Konformationsänderung Wechselionenstärke
+ kostengünstig, Proteinprobe ligandfrei, universell einsetzbar
- Denaturierungsrisiko, Aktivitätsverlust, zum Teil ineffizient - Konformationsänderugn pH Änderung
+ kostengünstig, universell, Proteinproben ligandfrei
- Denaturierungsrisiko/ Aktivitätsverlust, zum Teil ineffizient
Was ist der Unterschied zwischen Gruppenspezifischen und monospezifischen Liganden in der Affinitätschromatographie?
Monospezifisch --> passen nur zu einem Paratop
Gruppenspezifisch --> passen zu mehreren ähnlichen Paratopen (Christof, Christian, Christin)
Weclhe Schritte definiert die Affinitätschromatographie?
- Herstellen der Matrix
- Konditionieren derMatrix
- Beladen mit Probe
- Waschen
- Eluieren
- Regeneration der Matrix
Welche Proteine können mit Protein A/G Affinitätschromatographie aufgereinigt werden? Ist diese AC monospezifisch?
Mit Protein A/G können Antikörper aufgereinigt werden. Binden an Fc Teil, nicht monospezifisch, da Bindung mit allen Fc Teilen
Welche 5 Phasen unterscheidet man während der adaptiven Immunantwort?
- Infektion
- Erkennungs-
- Differenzierungs-
- Wirkungs-
- Abschaltphase
Wie kommt die Variabilität von Antikörpern zustande
- somatische Rekombination
- Gen Rearagement
- Somatische Hypermutation
Was ist die HuCAL Technologie
Human Combinatorial Antibody Library --> Masterbibliothek
Vor und Nachteile von rekombinanten Antikörpern
+ Produktion ohne Tiere in Bakterien
+ Nutzung der E.coli Technologie
+ Produktion von MAK ohne ineffiziente Fuisionsschritte
+ toxische Antigene möglich
- Mutationen müssen in PCR Runden durchgeführt werden
- alles muss in Durchsatz durchgeführt werden
- aufwändige Technologie
Was ist BiTE
Bispezifischer T-Cell
sehr hohe Bindungsaffinität
- bindet mit Paratop an Tumorzelle (schwächere Bindungsaffinität)
- bindet mit Paratop 2 an CD3 Moleküle auf T-Zellen
- Sterische Nähe von Tumorzelle & aktiviertem T-Lymphozyten führt zur Eliminierung der Tumorzelle
Worin unterscheidet sich ein Peptid vom Protein?
Proteine sind aus Peptiden aufgebaut,
Keine klare Abrengung wann ein Peptid ein Protein ist (ab ca. 100 AS), Proteine sind eher linearkettig (Primärstruktur), Proteine bilden eher Sekundäre, Tertiäre und Quartiäre Strukturen aus
Chemisch Struktur einer Peptidbindung zeichnen und erklären warum diese Bindung so stabil ist.
H2O wird abgespalten,
Doppelbindungscharakter zwischen CO und NH
planare Struktur ist sterisch --> optimal für die Delokalisierung von Elektronen
Ausbildung mesomerer Grenzstrukturen
Wie benennt man alpha und beta AS? Was kommt vor?
Von dem COOH C-Atom aus wird gezählt bis dort hin, wo die NH2 Gruppe gebunden ist
Protoinogene AS sind immer alpha
Gibt es bei Peptiden auch Sekundär- Tertiär- Quartiärstrukturen?
Ja, zwischen/innerhalb von Peptidketten können sich genauso ionische, polare und hydrophobe Wechselwirkungen ausbilden
Warum gibt es bei den alpha AS D & L Enantiomere? Welche der 20 protoinogenen AS ist nicht chiral?
Sobald ein chirales C-Atom in einem Molekül vorkommt, gibt es auch Enantiomere, also nicht deckungsgleiche Moleküle (Spiegelbilder)
Glycin ist die einzige AS die kein chirales C-Atom besitzt und damit auch keine Enantiomere ausbilden kann.
Welche AS sind bei pH 7 negativ geladen?
Asp und Glu
Welche AS sind bei pH 7 positiv geladen?
Arg, His, Lys
Welche AS sind hydrophil?
Arg, Asn, Asp, Gly, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr
Zeichnen Sie Alanin bei pH < 7 und pH > 7 an
zugabe Base --> pH > 7
zugabe säure --> pH < 7
Was bedeutet Chiralität?
Chiralität besitzen Moleküle die chirale C-Atome (4 versch. Liganden) besitzen.
Durch die unterschiedliche Anordnung der Liganden am C-Atom können die Moleküle durch keine Bewegung im Raum , sondern nur durch Spiegelung an einer Ebene zur Deckung gebracht werden.
Was sind Enantiomere?
Moleküle mit chiralem C-Atom, deren Ligandenverknüpfung sich unterscheidet und die sich ähneln wie Bild und Spiegelbild
Was ist ein Racemat?
Gemisch aus beiden Enantiomermolekülen
Was ist Stereoisomerie?
Isomere mit derselben Molekülverknüfung (werden in Enantiomere und Diastereomere unterteilt)
Was sind Diastereomere?
keine Spiegelbilder --> zum Beispil cis und trans
Warum ist das unterschiedliche Verhalten von Enantiomeren in chiraler Umgebung gerade für die Pharmaindustrie wichtig?
In einer chrialen Umgebung (Moleküle im Körper) wirken auch chriale Wirtstoffe unterschiedlich.
Im besten Fall ist das unpassene Enantiomer unwirksam, jedoch besitzt ein solches Enantiomer auch oft eine toxische Wirkung.
Was ist ein Helixbrecher?
--> β-verzweigte AS (Val, ILe, Thr => sterisch)
--> H-Brückenbildner Nähe Backbone (Ser, Asp, Asn)
--> Pro & N-alkyl-AS wirken nicht als H-Donor
Fischer Nomenklatur
1) längste C-Kette (mit COOH nach oben) von oben nach unten zeichnen
2) Horizontale Bindungen anpassen
3) wenn Aminogruppe links steht --> L-Form
CIP Nomenklatur
Liganden von C erhalten Platzierung je nach Ordnungszahl (größte = Platz 1)
letzte Platzierung wird nachhinten gedreht
Bei gleichen Liganden wird nächster gezählt, bei Doppelbindungen wird doppelt gezählt und Phantomatome in Klammern gesetzt
Wenn die Platzieungen im Uhzeigersinn aufsteigen --> R-Form, ansonsten S-Form
Was ist der Isoelektrische Punkt?
pH Wert(e) bei dem die Aminosäure in der Bilanz neutral geladen ist (Einzelladungen heben sich auf)
Was bewirkt die Methylierung der Lysine in Histone?
durch die Methylierung ist Lysin weniger stark positiv geladen --> Bindung zur DNA lässt nach --> Regulierung der Genexpression
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Flashcards
Erklären Sie die Abspaltung der temporären Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin?
Schutzgruppe kann unter scwach basischen Bedingungen abgespalten werden (unter sauren stabil)
Deshalb gut in Kombination mit Boc (tert-Butyloxycarbonyl) und C-Term Schutzgruppe tert-Butylester --> lassen sich mit Säure abspalten (Trifluoressigsäure)
H-Atom von Fmoc wird meist durch sekundäres Amin (Piperidin) entfernt --> kollabiert zu quasi-aromatischem System --> Proton von C9 des Fluorenyl-Rings kann unter milden Verhältnissen entfernt werden.
Entschützung innerhalb weniger Minuten --> UV-Absorpiton bei 280-310 nm --> Beobachten der Abspaltung
Warum ist in den letzten Jahgren sie Fmoc-Strategie in der Peptidsynthese stärker verbreitet als die Boc-Strategie?
- Die Abspaltung von Fmoc kann unter milderen Bedingungen (keine starke Säure, milde Base) ablaufen
- Die Abspaltung kann wegen der UV-Absorption beobachtet werden (280-310 nm)
- Fmoc ist technisch einfacher umzusetzen, außerdem wird für Boc wegen des HF Spezialausrüstung benötigt & ein geschlossener Synthesizer
Geben Sie den schematischen Aufbau von Homopolymeren, statistischen & alternierenden Copolymeren, von Blockpolymeren und von Pfropfcopolymeren und vernetzte Copolymere an.
Homopolymer: AAAAAAAAAAAAAA
Copolymere
a) alternierte: ABABABABABAB
b) statistische: ABBAAABBBBBBAAAABABAAA
c) Block: AAABBBAAABBBAAABBBB
d) Propf: AAAAAAAAAAAAAAAA
B B B
B B B
vernetzte: B B B
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Natürliche Biopolymere können unterschiedliche Struktur aufweisen. Geben Sie zu jedem Strukturtyp in der untern stehenden Tabelle den Namen eines Biopolymers an. Was bedeuten die Begriffe monodispers und polydispers in der Peptidchemie?
Monodispers: jedes einzelne Polymer hat eine einheitliche, gleiche Masse
verzweigt: Glykane, Oligosaccharide
linear: RNA, DNA, Peptide, Proteine
Polydispers: Massenverteilung bei den einzelnen Polymeren in einer Polymerkette
verzweigt: quervernetztes Elastin, Kollagen, Aggrecan, Glykogen
linear: Polysaccharide (HA, Zellulose), Amylose, PEG, PS, PMMA
Beschreiben Sie die Beladung der t-RNA mit AS. Wie wird die AS aktiviert? Wo wird die AS an der t-RNA gebunden?
Was ist der biologische Synthesizer?
AS wird über Aminoacyl-tRNA Synthetase (Enzym) unter ATP an tRNA gekoppelt
Einabu der AS am C-Terminus des Peptids
Aktivierung der AS über O-Atom das an t-RNA gekoppelt ist,
AS wird an die AS-Anhangsseite geknüpft.
Der biologische Syntheziser --> rRNA
Wie funktioniert die Translation am Ribosom?
Verknüpfung immer am C-Terminus
Ribosom besitzt A-Stelle (Aminoacyl), P-Stelle (Peptidyl) und E-Stelle (Exit)
An der P-Stelle befindet sich passende tRNA, wenn an die A-Stelle ebenfalls eine passende (beladene) tRNA bindet, kann Peptidbindung gebildet werden --> die Geometrie der tRNA und rRNA lässt dabei nur eine mögliche Bindugsreaktion zu .
Dann wandert die mRNA weiter, sodass die zweite tRNA mit der Peptidkette an der P-Stelle und die erste tRNA an der E-Stelle sitzt.
Was sind die Anforderungen an Schutzgruppen
allgemein: Abspaltung racemisierungsfrei, AS-derivat muss: löslich, lager- und synthesestabil sein
temporäre: Abspaltung darf permanente nicht beeinflussen, AS bildet kein Zwitterion,
permanente: Keine/geringe Nebenreaktionen bei Abspaltung
Eigenschaften von Boc und die Schutzstrategie bei Festphase temporär und permanent.
tert-Butyloxycarbonyl
stabil gegen: katalytische Hydrierung, basische Bedingungen
labil gegen: Wasserfreie TFA, HCl in Essigsäure
Strategie bei Festphase temporär:
Boc: temporär: schwach sauer (TFA)
Benzyl: C-Term/Harz: stark sauer (HF)
Benzyl: permanent: stark sauer (HF)
C-Terminus:
Boc an Merrifield-Harz
Boc Schutzgruppenstrategie bei Lösungssynthese, wie Funktioniert die Abspaltung?
temporäre: Boc (schwache Säure)
C-Term.: tBu (starke Säure), Benzyl (hydrogenolytisch)
Abspaltung durch Säure
Eigenschaften Fmoc und Strategie temprär bei Festphase
Fluorenylmethyloxycarbonyl
stabil gegen: Säure
Labil gegen: milde Basen (Piperidin)
Strategie:
Fmoc: temporär: schwach basisch
tBu: C-Term/Harz: sauer TFA
tBu: permanent: sauer, TFA
Was ist die Aufgabe des polymeren Trägers & des Linkers in der Festphasensynthese? Und ihre Anforderungen
Polymerer Träger: einfache Aufreinigung der Peptide
- quellbar in Syntheselösungsmittel, - stabil in allen Syntheseschritten, - gut filtrierbar (einheitliche Beadgröße)
Linker: Anschließende einfache Trennung des vom Träger (Sollbruchstelle), Freisetzung des gewünschten C-Terminus
- othogonale Abspaltung (bei allen Syntheseschritten stabil), - keine Nebenreaktionen, - Freisetzung freier Peptide
Merrifield-Harz zeichnen, was für ein Harz und welche gibt es noch?
Merriffield und PAM-Harz: Peptid-Säure
BHA- und MBHA-Harz: Peptid-Amid
Nennen Sie die wichtigsten permanenten Schutzgruppen, die zum Schutz der Peptidseitenkette in der Boc- bzw. Fmoc Synthesestrategie eingesetzt werden.
Boc:
Benzylgruppen: Asp, Glu, Cys, Ser, Thr, Thr, Lys
Tos: Arg, His
Fmoc:
tBu: Ser, Thr, Tyr
Boc: Lys, Trp,
Trt: Asn, Gln, His, Cys
Welche Termini können beim Abspalten der Trägerharzes entstehen?
A) Säure (COOH) --> Aldehyd (COH)
B) Säureamid (Epitopmapping) (CONH2) --> Alkohole (Inhibitoren) (OH)
c) Thioester (Ligationen) (COSR)
Was ist die Aufgabe von Kupplungsreagenzien?
- Carboxylgruppe muss aktiviert werden um Amidbindung zu bilden
- Wass er muss der Reaktion irreversibel entzogen werden
- Racemisierung muss verhindert werden
Welche Reagenztypen von Kopplungsreagenzien gibt es?
- Carbodiimide + Additive (Additive senken Razemisierung) saures Milieu
- Phosphoniumsalze, (Nebenreaktionen! --> nie im Überschuss!) basisches Milieu
- Uronium/Iminiumsalze (Aktivierung mit Hilfsbase) basisches Milieu
Nennen Sie zwei typische Nebenreaktionen die beim Kettenaufbau oder bei der Abspaltung des Peptids vom Trägerharz stattfinden
Kettenaufbau:
- Diketopiperazinbildung [Trityllinker verwenden]
- unzugänglicher Peptid-N-Terminus --> Kettenabbruch/Deletion [Hydrophile Harzmatrix, strukturbrechende Bausteine, Boc]
- Umlagerungsreaktionen mit Asp/Asn --> Konstitutionsisomere alpha/beta-Peptide [sterisch anspruchsvolle Schutzgrup.]
- Oxidation von Met zu Methioninoxid [Absaugen der Lösung unter O2 Ausschluss]
Kettenabbau
- Hydrolyse säurelabiler Peptidbindungen [Fmoc statt Boc]
- freigesetzte Schutzgruppe reagiert an anderer Stelle irreversibel an Peptid [Scavenger]
- Linker bindet irreversibel an Peptid [andere Linker verwenden, Scavenger]
- Pyroglutamatbildung am N-Terminus (Gln, Gln) [saure Bedingungen so kurz wie möglich]
- Oxidation von Met & Cys [Abspaltung v.a. bei Boc]
Wie werden die permanenten Schutzgruppen vom Linker abgespalten?
Fmoc: Trifluorethanol/ TFA
Boc: HF/TFMSA
Welche Kategorien von Nebenreaktionen bei der Abspaltung von permanenten Schutzgruppen/Linker gibt es?
- Umlagerung (AS dreht sich in der Kette)
- Fehlkopplug (Abbruch, Deletion)
- unvollständige Abspaltung (Schutzgruppen bleiben zurück)
- Di-keto-piperazinbildung (Bildung eines cyclischen Dipeptids)
Was sind Scavenger? Wozu werden sie eingesetzt? Nennen Sie die zwei Grundregeln des Scavenger Prinzip.
Beim Abspalten entstehen durch die Schutzgruppen reaktive Kationen --> müssen entschärft werden sonst können Seitenketten alkyliert werden --> durch Scavenger
Prinzip:
- Ähnliches schützt Ähnliches --> Scavenger sollten den empfindlichen Gruppen möglichst ähnlich sein
- Viel hilft viel --> Scavenger in möglichst hoher Konzentration
Optimale Konz muss experimentell bestimmt werden --> universelle Mischungen reichen meist aus um Nebenreaktionen zu verhindern
Nennen Sie eine Nebenreaktion die beim Kettenaufbau in der Synthese am Harz & eine die bei der Abspaltung vom Träger auftreten. Mit welcher Maßnahme kann diese Reaktion unterbunden werden?
Aufbau:
- Umlagerung von AS --> sterisch anspruchsvolle Schutzgruppen
absolute Vermeidung durch N-alkylierte Glycin-Derivate
Reduktion: durch Zugabe von schwach sauren Zusätzen zur Piperidin-Lösung
Abspaltung:
- Hydrolyse säurelabiler Peptidbindungen --> Boc Strategie
Reduktion: Einsatz von Scavenger
Wie kann Aggregation d.h. Ausbildung einer Sekundärstruktur bei der Peptidsynthese verhindert werden? Nennen Sie 2 Prinzipien. Wie macht das die Natur?
a) bessere Solvatisierung der Peptidkette
- durch Zugabe von Synthese-Lösungsmittel (Detergenzien, Lösungsmittel-Gemische, Dipole)
- Temperaturerhöhung
b) Störung der Wasserstoffbrückenbildung/ regelmäßigen Anordnung
Wie kann der Kettenabbruch/ die Deletion verhindert werden?
Störung der Wasserstoffbrückenbindungen
Störung der regelmäßigen Anordnung
Erklären Sie den Ablauf der schrittweisen bzw. konvergenten Peptidsynthese? Was sind Vor- und Nachteile?
LEGO-Strategie: sukzessives Anhängen von einzelnen AS-Bausteinen
- N-Terminale Schutzgruppe des bestehenden Peptids wird gespalten (Fmoc wird abgespalten)
- Kopplung eines Bausteins
- Nach Ender der Synthese -> Aufarbeitung
(+) Einfach --> schnell neue Peptidsequenzen, schnell, automatisierbar (Durchsatz)
(-) Limitierte Peptidlängen, je länger Peptid desto schlechter Reinheit, Harz & Linker sind für größere Maßstäbe zu teuer
Fertighaus-Strategie:
- Zusammenfügen von 2 längeren Peptidfragmenten, Abspalten von Fmoc und Harz, Fragmentkopplung in Lösung
(+) saubereres Endprodukt, bessere Ausbeute, höhere Flexibilität der permanenten Schutzgruppen
(-) Aufwand Synthesestrategie, Racemisierung, schlechte Kopplungsausbeute, schlechte Löslichkeit geschützter längerer Fragmente
Warum ist Glycin die ideale C-Terminale AS eines N-terminalen Peptidfragements in der Konvergemten Peptidsynthese?
Glycin ist die einzige nicht-chirale AS --> kein Racemisierugsproblem
--> Stabilität
Glycin sehr klein --> wird von der Natur bevorzugt in räumlich beengte Stellen eingebaut
Wie ist die Reinheit des Endprodukts bei stufenweiser Synthese bzw. Konvergenter Synthese? Welches Produkt kann leichter aufgereinigt werden?
Bei der Konvergenten Methode erhält man ein saubereres Endprodukt, gute Aufreinigungsmöglichkeit
Bei der Stufenweisen: je länger das Peptid, desto schlechter die Produktreinheit
Nennen Sie zwei chemische Ligationsmethoden
Ligationsmethode: chemische Verknüpfung von Peptid- &/oder Proteinfragmenten ohne Einsatz von Schutzgruppen über eine nicht peptidische Bindung
Zwei Methoden:
- Hydrazonkopplung
- Oximkopplung
- Thiazolidinkopplung "Click Chemie"
- Thioesterkopplung
Was ist der Unterschied zwischen chemischer und nativ chemischer Ligation?
Kovalente Verknüpfung von Peptid- und/oder Proteinfragmenten ohne Einsatz von Schutzgruppen durch
a) chemisch: nicht peptidische Bindung oder b) nativ chemisch: peptidische Bindung
Nennen Sie die 3 Anforderungen bei der chemischen Ligation
1) Spezifische Bindung von N-term mit C-term ohne Nebenreaktion
--> orthogonale Reaktivität
2) Löslichkeit der Fragmente --> da wässrige Umgebung
3) kein kritischer Bereich der Struktur für die Bindung auswählen
Skizzieren Sie das Prinzip der Ligation über Hilfsliganden
Was ist der Unterschied zwischen dem Aufbau von Proteinen über Fragmentkondensation oder Ligation?
Ligation: keine Schutzgruppen nötig
Kondensation: Schutzgruppen nötig
Welche Herausfoderungen beschäftigt die native chemische Ligation
- Thioester nur bei pH 3-6 stabil --> C-Terminale Thioester als Ausgangsprodukt ist Herausforderung
- Synthetische Peptidfragmente bis ca. 30-50 AS herstellbar --> sehr viele Fragmente für Proteine herstellen
- Cys Reste im Protein nicht sehr häufig --> artifizielles Protein mit vielen Cys Resten
--> Gefahr falscher, artifizieller Disulfidbrücken
Welches Problem besteht bei der Herstellung von Thioester bei der nativen chemische Ligation?
--> Thioester oxidieren Harz
Welche Synergien ergeben sich bei der Kombination der chemischen Peptidsynthese und der rekombinanten Peptidsynthese? Welche Anwendungen sind damit möglich?
rekombinante Technologie chemische Technologie
+ lange Fragmente möglich - Fragmente bis 30 bis max 60 AS
+ große Menge möglich - kleine Menschen
- lange Etablierungszeit + schnelle Verfügbarkeit
- nur natürliche und wenig andere AS + jede AS, Label, isotopenmarkierte Bausteine
--> In Kombination von den Vorteilen beider Verfahren profitieren
- Zelltoxische Proteine aus 2 nichttoxischen Exteinen über chemische Ligation
- Einbau stabil isotopenmarkierter AS in Proteine
- Einbau nicht-natürlicher AS in Proteine
- Einbau von Label, Farbstoffen, Affinitätstags
Was ist Splicing? Welche Splicing Varianten in der Biochemie kennen Sie?
Splicing ist der Vorgang bei dem aus einem Biopolymer innerhalb seiner Reifung ein Stück dieses Biopolymers entfernt wird und die übrigen Fragmente zusammengefügt werden.
Splicing in der Biochemie bei der mRNA und bei Proteinen.
prä-mRNA --> mRNA
Dabei werden die Introns (nicht codierende Gene) herausgeschnitten
Enzymatisches Entfernen der Introns und Ligation der Exons durch das Splicosom (Komplex aus 5 small nuclear RNA snRNA), ATP und weitere Proteine
Während der PTM
Inteine werden aus dem Protein herausgeschnitten und Exteine werden miteinander verknüpft --> neue Proteinprimärsequenz entsteht
Prozessierung: durch spontane chemische Umlagerung ohne enzymatische Aktivität
Erklären Sie die Schritte beim Splicing-Prozess.
1. Voraussetzung: Prä-mRNA mit konservierten Sequenzen (5´-GU Intron, 3´-AG Intron), Branch point A im Verzweigungspunkt des Introns
2. 5x snRNA bilden snRNP (small nuklear ribonuclein particles), wobei jede UE an einem der vorher genannten Punkte bindet
- Start: Bildung des Splicosoms (Konformation definiert durch Punkte auf prä-mRNA)
U1 bindet GU, U2 bindet A, Bindung tri-snRNP U4, U5, U6 - Umlagerung und Ligation (Konformation der mRNA im umgelagerten Spliceosom katalysiert 2x Transesterifizierung
- Freisetzung Intron - Exonprodukte (Nach 2. Transesterifizierung liegt vor Intron in Lassostruktur, Exon 1-Exon 2 Ligationsprodukt)
- Spliceosom zerfällt (snRNP und snRNA werden recycled)
Geben Sie die 5 Schritte des Protein Splicing Mechanismus an
- Thiazolidinbildung
- N->S Acylverschiebung
- Umesterung
- Abspaltung
- S->N Acylverschiebung/Endpodukt
Warum ist die Ligation von Phosphopeptiden mit Proteinfragmenten für die Untersuchung von Signalling Prozessen hilfereich?
Anhängen eines Phosphats an ein Protein --> Aktivierung des Proteins --> Aktivierung von Signalwegen
Hilfreich dadurch, dass synthetisierte Proteine direkt Aktiviert werden können und die Signalwege, die sie aktivieren analysiert werden können.
Medikamente können direkt in ihrer aktivierten Form synthetisiert werden
Was ist die Cystein-Methode?
Cystein als N-Terminale AS
-- > An C-Termini muss Thiolgruppe (SH) angefügt werden
--> Thiolgruppe des Cystein (N-Terminus) kann mit Thiolgruppe am C-Terminus eine Disulfidbrücke ausbilden --> kann Fragmente stabil verknüpfen --> Problem: falsche Ausbildung von Disulfidbrücken generiern fehlgefaltete Proteine
Wie nennt man die snRNA-Proteinkomplexe aus denen das RNA Spliceosom aufgebaut ist?
U1 U2 U4 U5 U6
