Histologie 2
5 Die Fixierung
5 Die Fixierung
Das liegenlassen von unfixiertem Gewebe in _____ ist verboten.
-> wieso?
Wasser:
-> wird aufgrund unterscgiedlichen osmotischen Druckes nachhaltig zerstört
Die Temperatur beeinflusst die Fixation wesentlich:
Erhöhung der Temperatur?
-Vor/Nachteil?
-wo kommt es in Betracht?
Herabsetzen der Temperatur?
-Vor/Nachteile?
-verwendung?
Erhöhen:
-kommt nur bei Formalin in Betracht
-schneller
-Autolyse noch nicht fixierten bereiche wird verstärkt
Herabsetzen:
-verlangsamt Autolyse
-verlangsamt Fixation
-Elektronenmikroskopie
Von was hängt die Dauer der fixierung ab? (4)
-Art, wie das Fixativ angeboten wird (Perfusion/Immersion)
-Diffusionsgeschwindigkeit des Fixatives
-Beschaffenheit des Gewebes
-Temperaturen
Was bedeutet Äquivalent und Artefakt?
Besipiele von Artefakten?
Äquivalent:
-das durch die Fixierung und histologische Technik wiederholbare Abbild der Wirklichkeit
Artefakt:
-nicht reproduzierbare Strukturveränderungen, de vom üblichen Äquivalent abweichen.
z.B.:
-mech. Schäden
-autolyse
-Schrumpfung/Schwellung
-Rindenbildung
-Fixierungsniederschläge
..
..
.
Welche Artefakt-Art?
Gründe?
(welches Organ?)
rechts: gute Fixierung
Autolyse:
-durch zelleigene Enzyme
-sobald die Durchblutung gestoppt wird
Gründe:
-nicht oder zu spät fixiert
(Dünndarm)
Welche Artefakt-Art?
Gründe?
(welches Gewebe?)
Schrumpfung/Quellung:
-osmotische Effekte
-deutlich an epithelzellen
Gründe:
-ungenügen fixiert
-Entwässerung zu schnell
-Wasserbad
(L:Dünndarmmusk, R:Prostata)
Welche Artefakt-Art?
Gründe?
-> welche Fixative?
R:gute Fixation
Rindenbildung:
-verhindert weiteres Vordringen des Fixatives
Bei stark entwässernden oder stark vernetzenden Fixativen wie z.B Alkoholoder Glutaraldehyd
Welche Artefakt-Art?
Gründe?
(welches Gewebe?)
Substanzflucht:
-Verlagerung der Zytoplasmatischen Einschlüsse (vorallem Glykogen), aufgrund eindringen des Fixatives
(Leberzellen)
Welche Artefakt-Art?
(welches Gewebe?)
Fixiermittelniederschläge:
-vorallem Formnalin
(Milz)
Was bedeutet Konservierung in der Histologie?
Welches Fixativ?
Konservierung in der Histologie wird das Längere Aufbewahren eines Gewebes in einem Fixativ verstanden.
-4% gepuffertes Formalin
Wie werden die Fixative nach Wikrungsweise eingeteilt?
Beispiele?
Vernetzende:
-Formalin
-Glutaraldehyd
Koagulierende:
-Alk
Essigsäure
Wie werden die Fixative nach Fixierungsmechanismus / Zusammensetzung eingeteilt?
Beispiele?
Fixierungsmechanismus:
-Vernetzung
-Salzbildung
-Wasserenzug
-ändern des Quellungszustandes
Formalin:
Definition
Aus was besteht es ? woraus gewonnen?
Was ist das Probleim beim Sonnenlicht?
4% gepuffertes Formalin ist das am meist verwendetste (aber nicht beste) Fixierungsmittel in der Histologie.
wird durch Oxidation von Methanol mit Luftsauerstoff gewonnen
kann durch sonnenlicht spontan zu Ameisensäre oxidieren -> Lichtgeschützt aufbewahren!
Formalin:
Wirkungsweise? (zwei schritte)
Vernetzung:
1)Bindung an reaktive Aminogruppe ->verhindert Autolyse
2)Bildung von stabilen Methylenbrücken -> eigentliche Vernetzung
Formalin:
Anwendung
Vor/Nachteile
Standartfixierumngsmittel:
-4% gepuufert
+einfach
+stabil gegen äussere Faktoren
+für fast alle Proben
+gute Morphologie
+gute Härtegrad
+wirkt als Desinfektionsmittel
-Fornalinpigmente
-Ätzend
-Reizung Augenbindehäute
-potenziell karzinogen
Alkohol 70%:
Anwendungsgebiet
Funktionsprinzip
Spezielles
-Knochenbiopsien
-Wasserenzug
-dient auch als Konservierungsmittel
-fixiert rasch --> dafür rindebildung je höher der alk
-fette können nicht mehr nachgewiesen werden
Bouin:
Anwendungsgebiet
Funktionsprinzip
Spezielles
-Hodenbiopsien
-Fixierungsgemisch (Formalinhaltig->vernetzung)
-''beste'' Fixierungsgemisch
-für empfindliches Gewebe
-Chromatinstruktur wird git erhalten (Hoden -> Abklärung von Fertilitätsstörung)
Glutaraldehyd/Karnovsky:
Anwendungsgebiet
Funktionsprinzip
Spezielles
-Elektronenmikroskopie
-Vernetzung
-Zellorganellen bleiben gut erhalten
-das Durchdringungsvermögen ist bedeutend kleiner
Auswaschen:
-wiso?
-mit was?
->beeinflussen Einbettung & Färbung ungünstig
-> Wasser oder Alk
-> gewebsentwesserungsautomaten mit 70%igem Alk
Alkohol 70%-90%
Anwendungsgebiet
Funktionsprinzip
Spezielles
-Harnsäure
-Wasserenzug
-dient auch als Konservierungsmittel
-fixiert rasch --> dafür rindebildung je höher der alk
-fette können nicht mehr nachgewiesen werden
Definition der Fixierung
Was ist bei der Definition zu beachten
Der Versuch Gewebe in möglicht lebensähnlichem Zustand zu erhalten.
->vollständig gilingt das nie
Welche drei wesentlichen Aufgaben hat die Fixierung?
1)Das Gewebe und seine Bestandteile in möglichst naturgetreuem Zustand erhalten
2)Gewebe stabilisierun und Härten
3)eventuell vorhandene Bakterien oder andere Kranheitserreger abtöten
1)Das Gewebe und seine Bestandteile in möglichst naturgetreuem Zustand erhalten
Was muss verhindert werden? (3)
Autolyse:
-zersetzung des Gewebes durch Körpereigene Enzyme
-setzt sehr schnell ein
-braucht keinen Sauerstoff
Fäulnis:
-Abbau von Gewebe durch ortsständige Bakterien der normalen Flora
-stark von äusseren Faktoren abhängig (Temp, Feuchtigkeit usw)
-Gestank
Verwesung:
-im Anschluss zur Fäulniss
-Bakterien, Schimmelpilze und tierische Lebewesen
-geruchslos
Das Ausmass und Geschwindigkeit der Autolyse ist abhängig von?
(3)
Enzymreichtum des gewebes:
-je enzymreicher, umso ausgeprägter
-Pankreas & Leber sehr Enzymreich, Muskulatur & Bindegewebe weniger
Temperatur:
-läuft bei dem Temp-Optimum (34-40Grad) am schnellsten ab.
-durch Kühlung kann die Autolyse verlangsamt werden
von der Zeit bis zur Fixierung:
-je länger die zeit zischen Entnahme und Fixierung, desto mehr Autolyse
2)Gewebe stabilisierun und Härten
Wiso?
Stabilisieren:
-möglichts wenig Zellflüssigkeit verlieren
-anschliessende Verarbeitungsschritte überstehen
Härten:
-schneidbar machen
3)eventuel vorhandene Bakterien oder andere Kranheitserreger abtöten
Wiso? (2)
-dient als Schutz des Laborpersonals
-verhindert Gewebszersetzung durch Fäulnis
Allgemeine Regeln der Fixierung:
9
1)sofort nach der Entnahme Fixieren:
-je schneller umso besser
2)genug Mittel verwenden:
-10-20Fache
3)genug grossen gefässe vewenden:
-gleichmässiges eindringen des Mittel ermöglichen
4)Gewebe nicht quetschen:
-druckempfindlich
-Artefakte vermeiden
5)kleine Präparate in toto fixieren:
-kleine bis mittelgrosse Gewebsstücke können direkt in Formalinlösung eingelegt werden
6)grosse Präparate einschneiden
-sollten in der Regel immer eingescghnitten werden
7)schwimmende Gewebe zudecken:
-Fett & Luftahltiges Gewebe (Mamma, Lunge usw)
-miet Fliesspapier oder Tücher
8)Fliesspapier als Unterlage:
-für stark bluitige oder klebriges Gewebe
9)genügen lang fixieren:
-nur wen Minimalzeit beachtet wird, wird das Gewebe genügen erhalten
''Grosse Präparate einschneiden'' ist eine Fixationsregel.
Wie ist das vorgehen bei foögendem Gewebe:
-Hohlorgan (Magen, Darm, Uterus)
-Organe mit bindegewebiger Kapsel
-Nierenresektate
-Lungenresektrate
Hoholorgane:
-werden geöffnet, entleert und dann fixiert
Organe mit bindegewebiger Kapsel:
-werden in paralelle Scheiben geschnitten, sodass sich die scheiben an der Unterseite zusammenhalten
Nierenresektate:
-werden einmal von der dem Hilus gegenüberliegenden Seite eingeschnitten.
Lungenresektrate:
-Perfusionsfixierung -> Injiziiert
Was ist der Unterschied zwischen physikalischer und chemischer Fixierung?
Welche Möglichkeiten gibt es?
Physikalisch:
Rein physikalische Vorgänge
-Kälte
-Trocknen
-Gefriertrocknen
Chemisch:
Fixierung durch Flüssigkeiten
-Formalin
-Alkohol
Auf welche zwei wege kann die chemsiche Fixierung erfolgen?
Immersionsfixierung:
-einlegen
-durch Diffusion
Perfusionsfixierung:
-Fixativ wird via Gefässystem ins Gewebe eingebracht
-fixierung von Lungenpräparaten
Welche drei Möglichkeiten bei der physikalischen Fixierung ?
Kälte:
-Gewebe wird möglichst Rasch auf tiefe Temp abgekühlt
--80Grad
Gefriertrocknen:
-eingefrorene Gewebsstücke werden vollständig im Vakuum entwässert
Trocknen:
-führt zur Deanaturierung der Proteine
-nur für sehhr dünne Proben
-Blutausstriche
Fixierung der Verschiedenen Stoffklassen Übersicht
Welche der Stoffklassen ist bei der Fixierung die wichtigste?
Proteine
Fixierung von Proteinen:
Welche art?
durch Koagulation:
-Fixierung durch denaturierung
-Hydrationsmittel wird enzogen -> Proteine fallen aus
Fixierung von Proteinen:
Welche art?
durch Vernetzung:
-Fixationsmittel baut sich zwischen die Proteine ein
-Proteine werden wenig oder nur minimal denaturiert
Fixierung von Lipiden:
Eine Fixierung der Fette ist nicht oder nur sehr schwer möglich.
Wie funktioniert es trotzdem?
Durch die Fixierung von Proteinen um die Fetteinlagerung, lassen sich Fette rämlich stabilisieren.
MERKE:
Legidlich eingeschlossen, nicht fixiert
Fixierung von Lipiden:
Wie entsteht das bekannt bild von Vakuolen nach der Fixierung?
-> welches Lösungsmittel?
Im Zuge der Aufbereitung werden die Fette herausgelöst -> Vakuolen
-> organischen Lösungsmitteln
Fixierung von Lipiden:
Durch welches Mittel ist es trotzdem möglich, Fette zu fixieren?
Osmiumtetroxid
Fixierung von Kohlenhydraten:
sind nur schwer zu fixieren, das sie ______ sind.
gut wasserlöslich
Fixierung von Kohlenhydraten:
Welche Kohlenhydrate sind praktisch nich möglich zu fixieren?
welche schon?
Niedermolekulare-> kaum möglich
Höhermolekulare -> durch Trapping
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Definition der Fixierung
Was ist bei der Definition zu beachten
Der Versuch Gewebe in möglicht lebensähnlichem Zustand zu erhalten.
->vollständig gilingt das nie
Welche drei wesentlichen Aufgaben hat die Fixierung?
1)Das Gewebe und seine Bestandteile in möglichst naturgetreuem Zustand erhalten
2)Gewebe stabilisierun und Härten
3)eventuell vorhandene Bakterien oder andere Kranheitserreger abtöten
1)Das Gewebe und seine Bestandteile in möglichst naturgetreuem Zustand erhalten
Was muss verhindert werden? (3)
Autolyse:
-zersetzung des Gewebes durch Körpereigene Enzyme
-setzt sehr schnell ein
-braucht keinen Sauerstoff
Fäulnis:
-Abbau von Gewebe durch ortsständige Bakterien der normalen Flora
-stark von äusseren Faktoren abhängig (Temp, Feuchtigkeit usw)
-Gestank
Verwesung:
-im Anschluss zur Fäulniss
-Bakterien, Schimmelpilze und tierische Lebewesen
-geruchslos
Das Ausmass und Geschwindigkeit der Autolyse ist abhängig von?
(3)
Enzymreichtum des gewebes:
-je enzymreicher, umso ausgeprägter
-Pankreas & Leber sehr Enzymreich, Muskulatur & Bindegewebe weniger
Temperatur:
-läuft bei dem Temp-Optimum (34-40Grad) am schnellsten ab.
-durch Kühlung kann die Autolyse verlangsamt werden
von der Zeit bis zur Fixierung:
-je länger die zeit zischen Entnahme und Fixierung, desto mehr Autolyse
2)Gewebe stabilisierun und Härten
Wiso?
Stabilisieren:
-möglichts wenig Zellflüssigkeit verlieren
-anschliessende Verarbeitungsschritte überstehen
Härten:
-schneidbar machen
3)eventuel vorhandene Bakterien oder andere Kranheitserreger abtöten
Wiso? (2)
-dient als Schutz des Laborpersonals
-verhindert Gewebszersetzung durch Fäulnis
Allgemeine Regeln der Fixierung:
9
1)sofort nach der Entnahme Fixieren:
-je schneller umso besser
2)genug Mittel verwenden:
-10-20Fache
3)genug grossen gefässe vewenden:
-gleichmässiges eindringen des Mittel ermöglichen
4)Gewebe nicht quetschen:
-druckempfindlich
-Artefakte vermeiden
5)kleine Präparate in toto fixieren:
-kleine bis mittelgrosse Gewebsstücke können direkt in Formalinlösung eingelegt werden
6)grosse Präparate einschneiden
-sollten in der Regel immer eingescghnitten werden
7)schwimmende Gewebe zudecken:
-Fett & Luftahltiges Gewebe (Mamma, Lunge usw)
-miet Fliesspapier oder Tücher
8)Fliesspapier als Unterlage:
-für stark bluitige oder klebriges Gewebe
9)genügen lang fixieren:
-nur wen Minimalzeit beachtet wird, wird das Gewebe genügen erhalten
''Grosse Präparate einschneiden'' ist eine Fixationsregel.
Wie ist das vorgehen bei foögendem Gewebe:
-Hohlorgan (Magen, Darm, Uterus)
-Organe mit bindegewebiger Kapsel
-Nierenresektate
-Lungenresektrate
Hoholorgane:
-werden geöffnet, entleert und dann fixiert
Organe mit bindegewebiger Kapsel:
-werden in paralelle Scheiben geschnitten, sodass sich die scheiben an der Unterseite zusammenhalten
Nierenresektate:
-werden einmal von der dem Hilus gegenüberliegenden Seite eingeschnitten.
Lungenresektrate:
-Perfusionsfixierung -> Injiziiert
Was ist der Unterschied zwischen physikalischer und chemischer Fixierung?
Welche Möglichkeiten gibt es?
Physikalisch:
Rein physikalische Vorgänge
-Kälte
-Trocknen
-Gefriertrocknen
Chemisch:
Fixierung durch Flüssigkeiten
-Formalin
-Alkohol
Auf welche zwei wege kann die chemsiche Fixierung erfolgen?
Immersionsfixierung:
-einlegen
-durch Diffusion
Perfusionsfixierung:
-Fixativ wird via Gefässystem ins Gewebe eingebracht
-fixierung von Lungenpräparaten
Welche drei Möglichkeiten bei der physikalischen Fixierung ?
Kälte:
-Gewebe wird möglichst Rasch auf tiefe Temp abgekühlt
--80Grad
Gefriertrocknen:
-eingefrorene Gewebsstücke werden vollständig im Vakuum entwässert
Trocknen:
-führt zur Deanaturierung der Proteine
-nur für sehhr dünne Proben
-Blutausstriche
Fixierung der Verschiedenen Stoffklassen Übersicht
Welche der Stoffklassen ist bei der Fixierung die wichtigste?
Proteine
Fixierung von Proteinen:
Welche art?
durch Koagulation:
-Fixierung durch denaturierung
-Hydrationsmittel wird enzogen -> Proteine fallen aus
Fixierung von Proteinen:
Welche art?
durch Vernetzung:
-Fixationsmittel baut sich zwischen die Proteine ein
-Proteine werden wenig oder nur minimal denaturiert
Fixierung von Lipiden:
Eine Fixierung der Fette ist nicht oder nur sehr schwer möglich.
Wie funktioniert es trotzdem?
Durch die Fixierung von Proteinen um die Fetteinlagerung, lassen sich Fette rämlich stabilisieren.
MERKE:
Legidlich eingeschlossen, nicht fixiert
Fixierung von Lipiden:
Wie entsteht das bekannt bild von Vakuolen nach der Fixierung?
-> welches Lösungsmittel?
Im Zuge der Aufbereitung werden die Fette herausgelöst -> Vakuolen
-> organischen Lösungsmitteln
Fixierung von Lipiden:
Durch welches Mittel ist es trotzdem möglich, Fette zu fixieren?
Osmiumtetroxid
Fixierung von Kohlenhydraten:
sind nur schwer zu fixieren, das sie ______ sind.
gut wasserlöslich
Fixierung von Kohlenhydraten:
Welche Kohlenhydrate sind praktisch nich möglich zu fixieren?
welche schon?
Niedermolekulare-> kaum möglich
Höhermolekulare -> durch Trapping
Fixierung von Kohlenhydraten:
Was bedeutet Trapping?
Die Höhhermolekularen Kohlenhydrate wie Glykosaminoglykane oder Glykogene werden durch das Proteinnetz, welches durch die Fixierung enstanden ist, ''gefangen'' -> Tapping
Fixierung von Kohlenhydraten:
Der Glykogennachweis ist in der Leber und Muskelpatho wichtig. Glykogen ist schwer wasserlöslich und wird daher über Trapping fixiert.
In wässrigen Fxativen wird es aber abgebaut, wie auch beim Färben.
-> Welche Fixative werden optamlerweise verwendet?
Alkoholhaltige:
-Cornoy
-70-95% Alk
Fixierung von Nukleinsäuren:
Wie wird es Fixiert? (2)
-> wie Proreine
-> zusätzlich stabilisierende Effekt wie bei den HöhermolekularenKohlenhydraten
Fixierung von Kohlenhydraten:
zu speziellen Dartsellung der Chromosomen werden ___________ Fixationsmittel verwendet.
essigsäurehaltige
Welche Faktoren beeinflussen die Fixierung? (4)
-pH-Wert
-Osmolarität
-Temperatur
-Dauer
Einfluss pH:
Saurer pH
physiologischer pH
basicher pH
Saurer pH:
-auf die Morphologie kienen Einfluss
-für darstellung von Chromosomen sogar erwünscht
-Immunhistochemie und Molekularpathologie nicht mer möglich
physikalischer pH:
-auf die Morphologie kienen Einfluss
-für immunhistochemie & molekularpathologie von zentraler Bedeutung
basischer pH:
-pH-Werte über 8 sind nich erlaubt
Wiso ist bei der Immunhistochemie und Molekularpathologie ein physiologischer pH von grosser bedeutung?
->Enzyme, Antigene, DNS werden beu saurem pH negativ beeinflusst
Wesahlb ist ein pH über 8 nicht erlaubt?
-Laugen zerstören das Gewebe
Osmolarität des Fixationsmittel beeinflusst das gewebe: _____ fixierlösungen lassen das Gewebe anschwellen, _____ Fixierungsmitteln führen zu Schrumpfungen.
Hypotone
Hypertone
Das liegenlassen von unfixiertem Gewebe in _____ ist verboten.
-> wieso?
Wasser:
-> wird aufgrund unterscgiedlichen osmotischen Druckes nachhaltig zerstört
Die Temperatur beeinflusst die Fixation wesentlich:
Erhöhung der Temperatur?
-Vor/Nachteil?
-wo kommt es in Betracht?
Herabsetzen der Temperatur?
-Vor/Nachteile?
-verwendung?
Erhöhen:
-kommt nur bei Formalin in Betracht
-schneller
-Autolyse noch nicht fixierten bereiche wird verstärkt
Herabsetzen:
-verlangsamt Autolyse
-verlangsamt Fixation
-Elektronenmikroskopie
Von was hängt die Dauer der fixierung ab? (4)
-Art, wie das Fixativ angeboten wird (Perfusion/Immersion)
-Diffusionsgeschwindigkeit des Fixatives
-Beschaffenheit des Gewebes
-Temperaturen
Was bedeutet Äquivalent und Artefakt?
Besipiele von Artefakten?
Äquivalent:
-das durch die Fixierung und histologische Technik wiederholbare Abbild der Wirklichkeit
Artefakt:
-nicht reproduzierbare Strukturveränderungen, de vom üblichen Äquivalent abweichen.
z.B.:
-mech. Schäden
-autolyse
-Schrumpfung/Schwellung
-Rindenbildung
-Fixierungsniederschläge
..
..
.
Welche Artefakt-Art?
Gründe?
(welches Organ?)
rechts: gute Fixierung
Autolyse:
-durch zelleigene Enzyme
-sobald die Durchblutung gestoppt wird
Gründe:
-nicht oder zu spät fixiert
(Dünndarm)
Welche Artefakt-Art?
Gründe?
(welches Gewebe?)
Schrumpfung/Quellung:
-osmotische Effekte
-deutlich an epithelzellen
Gründe:
-ungenügen fixiert
-Entwässerung zu schnell
-Wasserbad
(L:Dünndarmmusk, R:Prostata)
Welche Artefakt-Art?
Gründe?
-> welche Fixative?
R:gute Fixation
Rindenbildung:
-verhindert weiteres Vordringen des Fixatives
Bei stark entwässernden oder stark vernetzenden Fixativen wie z.B Alkoholoder Glutaraldehyd
Welche Artefakt-Art?
Gründe?
(welches Gewebe?)
Substanzflucht:
-Verlagerung der Zytoplasmatischen Einschlüsse (vorallem Glykogen), aufgrund eindringen des Fixatives
(Leberzellen)
Welche Artefakt-Art?
(welches Gewebe?)
Fixiermittelniederschläge:
-vorallem Formnalin
(Milz)
Was bedeutet Konservierung in der Histologie?
Welches Fixativ?
Konservierung in der Histologie wird das Längere Aufbewahren eines Gewebes in einem Fixativ verstanden.
-4% gepuffertes Formalin
Wie werden die Fixative nach Wikrungsweise eingeteilt?
Beispiele?
Vernetzende:
-Formalin
-Glutaraldehyd
Koagulierende:
-Alk
Essigsäure
