Molekulare Humangenetik

Krankheit:

- Intelligenzminderung, 

- Autismus

- Epilespie, 

- grosse, lange Ohren

- schmales Gesicht

- Sprachstörungen

Ursachen:

- (CGG)n Wiederholungen im Fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene -> vermindertes Vorhandensein des Proteins, welches für die normale Entwicklung wichtig ist. 

Diagnose:

- Southern Blot (für kleine Änderungen)

- PCR (keine Info über Methylierung -> Expressionszustand des Chromatids)

DNA-Segmente, welche zu echten Genen verwandt sind aber gewisse Funktionalität verloren haben:

-> Keine genexpression

-> protein-kodierende Eigenschaft

p53 stimuliert die Transkription von p21, was dann die Cyclin E und Cyclin Ds inhibiert. Somit wird das Rb nicht phosphoryliert -> S-Phase bleibt gehemmt und somit weniger Proliferation. p53 ist zwar nicht essentiell, aber die Frequenz wird durch die Absenz erhöht. 

= Inhibition endogener Genexpression

A: RNAse H erkennt den DNA-RNA Duplex und schneidet die mRNA

C: Zucker-modifizierte Oligonukleotid wird zwar nicht durch RNAse H erkannt, aber verhindert die Translation

Limitationen: Einschleusen der Oligonukleotide -> Exonukleasen bauen die Oligonukleotide ab

Ist eine Ausnahme der retroviralen Onkogenese -> trägt keine zellulären Onkogene und verursacht keine cis-aktivierung von Onkogenen. 

Tax ist wichtig für virale Genexpression und Replikation, wird durch den Virus exprimiert. Interagiert auch mit zellulären TFs -> erhöht die Proto-onkogene, Zykline, T-Zellen stimulierende Faktoren

Meist asymptomatisch, kann aber in 2-5% der Menschen Krebs verursachen

= Sequencing by synthesis, eines ssDNA stranges

1. immobiler ssDNA strang
2. Man spült eine Base aufs mal 
3. DNA Polymerase integriert die eine Base, wobei ein PPi entsteht, welches mit zur ATP herstellung führt und die Aktion von Luciferase aktiviert
4. Luciferase wandelt Luciferin in Oxyluciferin um, wobei messbares Licht produziert wird, proportional zur Menge ppi, welches entstanden ist.  
5. Da man weiss, welche Base herübergespült wurde, weiss man auch die Base der entsprechenden position

Man kann leider nur kurze reads machen (300-500 bp). 

Für nicht-X gekoppelte Deletionen Nachweise

1. isoliert einen Chromosomensatz eines gesunden (Kontrolle) und des kranken (zu testenden)
2. partieller Verdau und dann fluoreszenz-Markierung in Farben (1 Farbe für krank, 1 für kontrolle)
3. Mischen der DNA in Menge 1:1
4. Hybridisierung der Proben zu normalen chromosomen
5. Gain einer DNA -> shift zur Farbe des test; Verlust einer DNA -> shift zur Farbe der Kontrolle; Beides: shfit zur Mischfarbe

1. Depurinierung: A/G --> A/C/G/T (spontaner Basenverlust)
2. Desaminierung C -> T (Transition)
3. Desaminierung von 5-m-cytosin zu Thymin
4. Guanin -> Thymin

Hemmt die Apoptose durch Cytochrom C des Mitochondriums und führt so zu Krebs. Stimuliert aber nicht das Wachstum oder die Proliferation

Eine translokation zwischen Chr. 14 und 18 kann zu follikulärem Lymphom führen (follicular center lymphoma). 

Ist ein Werkzeug der Zelle, um Genmutationen zu reparieren. Voraussetzung dafür sind homologe, dsDNA Abschnitte. Homolog heisst, dass es grössere Ähnlichkeiten zwischen den DNA sequenzen gibt. 

Wenn die gezielte und gewollte Rekombination stattfindet (selten), wird die Thymidinkinase (TK) nicht mitintegriert. Bei der 2. Selektion mit Ganciclovir, werden alle Zellen, welche das Insert random integriert haben und somit das TK auch tragen, wandeln Ganciclovir in ein toxisches Produkt um und gehen unter. 

Zum beispiel HER-2, EGFR

ein mutierter Rezeptor könnte konstante Tyrosin-Kinase Aktivität aufweisen, auch wenn kein Ligand gebunden ist

Defekt im NER

- es entwickeln sich tausende sommersprossen und Hautkrebs (Mutation im p53 Gen und Hautzellen).

Bei falschen Basenpaarungen bei der DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur können 2 falsche Basen miteinander gepaart werden:

- behoben wird das durch hMutSalpha + hMutLalpha, PMS2 + MLH1

= small interfering RNA

- ist wie miRNA auch teil des RNAi systems und dient als Schutz vor transponierbaren Elementen

1. Exogene dsDNA wird erkannt und durch DICER in kleinere, kurze Stränge abgebaut

2. Ago + andere Proteine binden an einen guide strang -> activated RISC komplex, welcher dann komplementärstränge abbaut

ist meist rezessiv vererbt

- Beta-Thalassämie: Mutationen der TATA-Box

- Alpha-Thalassämie: TAA -> CAA Substitution verlängert das Genprodukt um 31 Aminosäuren -> instabiles Genprodukt

ca. 16'569 Bp

66% protein kodierend

32% RNA gene regulatorische Sequenzen

<2% anderes

allgemeine Eigenschaften:

1. ringförmiger doppelstrang
2. 1000 Kopien/Zelle
3. rRNA/tRNA und protein kodierende Gene
4. keine Introns
5. keine Rekombination
6. H- und L-Strang -> es gibt 2 grosse Primärtranskripte, welche dann zu mRNAs geschnitten werden
7. 37 Gene(kann man nur schwer in mit importieren): oxidative Phosphorylierung, benötigen aber auch nukleär kodierte Proteine 

Schwerwiegende Mutation im COL1A1-locus 17q -> Keine Expression -> leichte Form führt zur 50% des normalen Kollagengehaltes

missense Mutation -> Expression von anormalen Kollagen-> schwere Form führt zu 25% normalen kollagengehalt

Ist nicht geeignet, wenn schon irreversible Schäden entstanden sind. man gibt einfach mehr des gens in die Zelle und erhöht somit die Produktion des richtigen Genprodukts

Im Virusgenom sind die Gene, welche p53 oder pRb inaktivieren deletiert. D.h. sie wachsen nur dort, wo es onehin wenige hat (in Tumorzellen). Oder man kontrolliert die Expression durch einen Tumorspezfischen Promotor. Das Immunsystem bekämpft onkolytische Viren -> wenn sie aber gezielt tumorzellen infiieren, dann bekämpft das Immunsystem gezielt den Tumor -> Personalisierte Krebs-Impfung

Human papilloma virus

low risk HPV:

• führt nicht zu krebs
• E6/E7 verlangsamen Zellzyklus-Arrest und Zelldifferenzierung
• Warzenbildung 
• episomale Vermehrung

High risk HPV:

• führt zu Krebs
• hat die tendenz, sich ins Wirtsgenom zu integrieren -> zerstörung des E2 Gens -> E6/E7 produktion steigt -> Krebs
• Kann zu Zervixkarzinomen führen, was aber durch den Pap-Test verhindert werden kann
  • HPV16 ist ein Hochrisiko-Stamm (>50% der Zervixkarzinomen)

ist ein Beispiel des 2-hit Mutationsmodells. Es braucht inaktivierung beider pRb enkodierender Gene. Dass dies in einem Leben, in der Selben Zelllinie 2 mal geschieht ist sehr unwahrscheinlich. Wahrscheinlicher ist eine schon vererbte inaktivierte Rb Form und dann eine inaktivierung im Leben. 

GTP-locked -> Mutation im aktiven Zentrum der GTP activating protein, dann kann das GTP nicht hydrolysiert werden und die Signalisierung nicht unterbrochen werden. 

Es handelt sich um eine somatische Mutation im GNAS1-Gen. Galhpas stimuliert konstant die Adenylatzyklase -> CREBP Gene -> überaktivität und schlussendlich onkogen. 

Ist eine postzygotische Mutation

Knochenfehlbildungen, Störung der Osteoblasten differenzierung, Bildung von fibrösen BG-ähnlichen Gewebe

Online mendelian inheritance in man

- Katalog von menschlichen Genen und genetischen Krankheiten

Führt zu sarkomen in Hühnern. 

c-Src führt zu einem cytosolischen non-receptor tyrosine kinase

Der auslösende Virus ist ein retrovirus, welcher für das src protein kodiert und somit zur Tumorbildung beiträgt. 

Spo11 und Mre11 nuclease complex entfernen die DNA

Es kommt zu strand invasion durch RecA protein binding

Beim schneiden kann es zum CO oder nicht kommen

= funktionell ähnliche Gene, welche nahe beieinander liegen. Sind durch tandemartige Genduplikationen entstanden bei ungleicher Rekombination (Meiose)

- alpha- und Beta- Globin Gencluster

- Albumin cluster

- Human Leukocyte antigens

Abschnitt einer DNS, welcher die Information für die Herstellung einer biologisch aktiven RNA enthält

1. Grösse: 200-300nm 
2. keinen eigenen Stoffwechsel
3. keine proteinproduzierende Strukturen
4. keine Vermehrung ausserhalb der Zellen
5. obligat intrazelluläre Parasiten
6. stimulieren die Wirtszlle dazu, neue Viruspartikel zu produzieren. 

Detektion von bestimmten DNA Sequenzen in DNA samples:

1. Suche nach homologen Genen

2. Identifikation von Mutationen, Deletionen und Additionen

Anwendung:

Beta-Thalassämie -> von EcoRI verdauter DNA

Fragiles X-Chromosom

= Sanger sequencing

Einzelstrang der zu sequenzierenden DNA wird jeweils mit 4 normalen Basen (dATP, dGTP...) + eine dideoxy Base überspült (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP). D.h. es hat 4 reaktionen, pro reaktion hat es eine Art dideoxy-Base drin. Dann werden Fragmente unterschiedlicher Länge generiert. Sind die dideoxys markiert, kann man dann eine Gelelektrophorese laufen lassen und die Seuquenz ablesen. 

• aufgrund von Spleissmutationen
• ist eine dominante BG-Krankheit, abnorme Wundheilung und Haut überdehnbar
• Typ V Kollagen-kodierende COL5A1 -> hat eine Mutation in der Splice akzeptor Stelle -> anormale Kollagen-Fibrillen Architektur
• IVS4-2A-G Spleissakzeptor-Mutation -> es wird eine kryptische Akzeptorstelle aktiviert

Function as RNA silencers and post-transcriptional regulation of gene expression. 

- Werden durch RNA Pol II transkribiert

- sind polyadenyliert und 5'gecappt

- stammen von kürzeren RNA transkripten ab, welche über sich falten und eine Hairpin struktur bilden

Werden im ZK transkribiert -> pri-miRNA(mit kappe und polyA) wird durch RNAse Komplex bearbeitet (entfernen der Cap und PolyA) -> pre-miRNA, welche dann vom Nucleus exportiert wird.

Im Cytoplasma wird der Hairpin durch den DICER entfernt, der miRNA trifft dann auf RISC complex und dient als guide strand (nachdem ein Strang, der passenger Strang, durch den Argonaute complex entfernt wurde). 

der guide strang ist die reife miRNA, welche dann die komplementären mRNAs erkennt -> Entweder Abbau der mRNAs oder Hemmung der Translation.

1. Unabhängigkeit von Wachstumssignalen
2. Insensitivität gegenüber Wachstums-Inhibitoren
3. Neigen dazu, Apoptose zu vermeiden
4. umgehen replikative Alterung und Differenzierung
5. Verlassen das Heimatgewebe und metastasieren
6. halten die Angiogenese aufrecht

Selektive Amplifizierung meherer Sequenzen aus einer gesamt DNA mithilfe Hitzestabiler Polymerasen

Polymerase: Pyrococcus furiosus mit 3'-5' Korrekturlesefunktion

Einschränkung: kleine Fragmente

Beispiel: Dystrophin-Gen Deletionen

- ist ein Protein in der Muskelfasermembran (Bindeglied zwischen Aktin und Dystroglycan)

- wenn es fehlt, Muskelschwäche- & -schwund durch: 

• Muskelfasermembran-Ruptur
• Kreatininase-Freisetzung
•  

- Dystrophin ist eines der grössten Gene (2,5*10^6 Bp)

- man schaut sich 9 Exone an

- Vererbung des Defekts: X-gekoppelt rezessiv

- nicht anwendbar bei heterozygoten Frauen. 

Aktivatoren: 

- vascular endothelial growth factor (VEGF)

- fibroblast growth factor (FGF)

- hypoxia-induced factor HIF

Inhibitoren:

- Thrombospondin-1

- Endostatin

CAR besteht aus einem scFV(single-chain variable domain) -> enstpricht den Antigen-erkennenden L- und H- Kette von Ak 

scFV ist verbunden mit TM und Signaltransduktionsdomäne -> entspricht TCR CD3 Domäne

Kostimulatorische Interaktionen fördern die Expansion, Aktivtät und Zytotoxizität der CAR-T Zellen

Adenosinde deaminase deficiency severe combined immunodeficiency

ADA Mangel führt zu Ansammlung von dATP -> Hemmt die DNA synthese -> mitotisch aktive Zellen wie B und T Lymphozyten können sich nicht teilen. Ansammlung von Produkten, welche für unreife lymphozyten toxisch sind. Die konventionelle Behandlung war die Gabe des PEG-ADA Enzyms (Überleben 10-12 Jahre), alternative Knochenmarkstransplantationen.

Gentherapie:

- Ex-vivo behandlung von T-Lymphozyten mit retroviralen Vektor für das menschliche ADA Gen. 

- Verbesserung, aber keine Heilung der Krankheit