10 a Praktikum - PCR Restiriktionsanalyse

Enzyme, die Nukleinsäuren abbauen, werden als Nukleasen bezeichnet.

Sie hydrolysieren eine der beiden Phosphoesterbindungen zwischen zwei Nukleotiden.

Endonukleasen können die Nukleinsäure an jeder beliebigen Stelle in kleinere Bruchstücke spalten, während Exonukleasen die Nukleinsäure von einem Ende des Moleküls her abbauen.

Eine besondere Bedeutung als Werkzeuge in der Gentechnologie haben Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzyme), die nur bei Bakterien vorkommen. Bakterien schützen sich mit Hilfe dieser Enzyme vor dem Eindringen fremder DNA. Ihre eigene DNA wird mit spezifischen Methylasen durch Anheftung von Methylgruppen modifiziert. Fremde, in die Bakterienzellen eingedrungene DNA, unterliegt dieser Modifikation nicht. Sie wird deshalb durch die Restriktionsenzyme hydrolysiert und verliert ihre biologische Funktionalität.

Restriktionsenzyme werden in drei grosse Klassen eingeteilt. Typ I und III der Restriktionsenzyme binden an ihre Erkennungssequenzen, spalten die DNA aber an einer entfernten Stelle. Im Gegensatz dazu spalten die Restriktionsenzyme des Typs II die DNA innerhalb ihrer Erkennungssequenzen.

Die meisten Erkennungssequenzen sind umgekehrte Wiederholungssequenzen mit einer Symmetrieachse (Palindrome) und vier bis acht Basenpaare lang. In Abbildung 1 ist die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI gezeigt. Diese Abkürzung steht für Escherichia coli, Stamm RY13, Restriktionsenzym I.

Die meisten Restriktionsenzyme bestehen aus zwei identischen Proteinuntereinheiten. Jede Untereinheit erkennt und spaltet die DNA auf einem der beiden Stränge. Dies führt zu einem Doppelstrangbruch. Viele Restriktionsenzyme des Typs II führen versetzte Schnitte durch, aus denen kurze, einzelsträngige Überhänge hervorgehen, die sogenannten klebrigen Enden (sticky ends). Andere Restriktionsenzyme spalten beide DNA-Stränge an genau gegenüber liegenden Stellen, was zu glatten Enden (blunt ends) führt.

(Durch den Einsatz verschiedener Restriktionsenzymen kann man eine genau definierte Sequenz aus einem DNA-Strang herausschneiden. Die entstehenden DNA-Fragmente können dann z. B. in mit den gleichen Restriktionsenzymen behandelte Plasmidvektoren zur Genexpression in E. coli eingesetzt werden. Heute sind etwa 300 Restriktionsenzyme mit unterschiedlichen Erkennungssequenzen kommerziell erhältlich. Die Tabelle 1 listet einige Restriktionsenzyme auf.)

DNA-Fragmente lassen sich in der Gelelektrophorese mithilfe eines elektrischen Feldes nach ihrer Grösse trennen. Das Gel einer solchen Gelelektrophorese besteht üblicherweise aus Agarose, einem gelatineähnlichem Polysaccharid, das aus Meeresalgen gewonnen wird. Agarose ist ein Pulver, das sich nur in heissem Wasser löst. Kühlt die Lösung ab, dann erhärtet die Agarose. Um die DNA aufzutrennen und sichtbar zu machen, lässt man die Lösung auf einem horizontalen Träger abkühlen, wodurch ein flaches Gel von etwa 6 mm Dicke entsteht. An einem Ende wird vor dem Abkühlen ein Kamm eingeschoben. Nach dem Erhärten wird der Kamm gezogen und in dem Gel bleiben kleine Taschen zurück.

Die Grösse der untersuchten DNA bestimmt die Art des Gels, das für die Auftrennung verwendet wird. In der Regel ist es Agarose, doch sehr kleine DNA-Moleküle zwischen 50 und 1000 Basenpaare werden mithilfe von Polyacrylamidgelen getrennt. Diese Gele vermögen DNA-Fragmente zu separieren, die sich in ihrer Länge nur durch ein einziges Basenpaar unterscheiden, z.B. nach einer DNASequenzierung.

Das Agarosegel wird in einer Kammer, die an einem Ende eine positive Elektrode (Anode) und an dem anderen Ende eine negative Elektrode (Kathode) besitzt, mit Puffer überschichtet. Anschliessend werden die DNA-Proben in die Geltaschen geladen (Abb. 2) und eine elektrische Spannung angelegt. In dem entstehenden elektrischen Feld wandern die DNA-Fragmente nun durch das Gel. Das Phosphatrückgrat der DNA ist negativ geladen, so dass sich die Fragmente zur Anode bewegen. Dabei wirkt die erstarrte Agarose als Sieb mit kleinen Poren zwischen den einzelnen Agaroseketten. Die DNA-Fragmente müssen sich durch diese Poren zwängen und werden nach ihrer Grösse aufgetrennt, weil grössere Moleküle stärker behindert werden als kleinere.