10 a Praktikum - PCR Restiriktionsanalyse

Fremde Proteine können für E. coli toxisch sein, wenn sie in grossen Mengen hergestellt werden. Deshalb ist der Promotor, der die Expression der Fremd-Gene steuert, entscheidend. Um die Proteinsynthese zu regulieren, besitzen Expressionsvektoren Promotoren mit "an/aus"-Schaltern. Die Bakterienzellen vermehren sich zunächst und das Fremd-Protein wird erst zu einem späteren Zeitpunkt exprimiert.

Ein häufig verwendeter Expressionsvektor ist pET (Abb. 5). Als Selektionsmarker enthält er ein Ampicillinresistenzgen (ampR). Vor der Polyklonierungsstelle (MCS) liegt der Lactoseoperator (lacO), gefolgt vom Promotor für die virale RNA-Polymerase T7. Auch enthält das Plasmid das lacI-Gen, das für den lac-Repressor codiert. Der lac-Repressor bindet an den lac-Operator im Plasmid und verhindert die Transkription der T7-Polymerase.

In den transformierten Bakterienzellen werden die Plasmide vermehrt und die virale RNAPolymerase T7 unter der Kontrolle des lac-Promotors exprimiert. Nun setzt man den künstlichen Induktor Isopropylthiogalactosid (IPTG) zu. IPTG bindet an den lacI-Repressor, der dann den Operator frei gibt. Damit sind in der Zelle grosse Mengen an T7-RNA-Polymerase vorhanden, und die Transkription der zu exprimierenden DNA kann beginnen. Es wird sehr viel mRNA synthetisiert, die rasch in Protein translatiert wird.