Protein-Protein-Interaction

Protein-Protein-Interaktionen in Hefen.
Eine wesentliche Voraussetzung für dieses System ist, dass Transkriptionsfaktoren
(TF) aus zwei getrennten Domänen bestehen: der DNA-Bindungsdoma ne (BD) und der
Aktivierungs- Domäne (AD).

Werden diese beiden Domänen voneinander getrennt, kann nur bei enger räumlicher
Assoziation ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor resultieren. Hierbei erkennt der
TF definierte upstream activating sequences und bindet an den Promotor, so dass die
Transkription der nachgeschalteten Gene initiiert werden kann.

nutzt zwei Hybridproteine

• DB-bait-Protein
  • Hybrid aus der BD des TF Gal4 und dem bait-Protein
  • Interaktionspartner gesucht und getestet
• AD-prey-Protein.
  • Hybrid aus der AD des TF Gal4 und dem prey-Protein
  • ein möglicher Interaktionspartner des bait-Proteins.

Wenn beide Hybridproteine in der Hefezelle vorkommen und wenn eine Interaktion zwischen bait und prey besteht, entsteht ein funktionsfähiger Gal4 TF und sogenannte Reportergene werden expremiert.

Im Genom der kompatiblen Hefe-Stämme befinden sich diese Reportergene
nachgeschalten zu Gal4-Bindungsstellen.Drei Reportergene sind üblich

• Hefegen HIS3
• Hefegen URA3
• bakterielle LacZ-Gen.

HIS3 und URA3 sind Gene zur Synthese von Histidin bzw Uracil. Somit können Hefen, die einen funktionierenden Gal4 TF haben, mit dem entsprechenden Medium selektiert werden.

Das lacZ-Gene kodiert für b-Galactosidase. Wird dieses Protein expremiert kommt es
bei der Zugabe von Xgal zu einer Blaufärbung der Hefezelle.

Somit kann kontrolliert werden, ob bait und prey miteinander interagieren.

• Herstellung der Plasmide mit den Fusionsgenen
• Transformation der Hefe mit den Plasmiden
• Selektion der doppelt transformierten Hefen
• Kontrolle auf PPI durch geeignetes Selektionsmedium und/oder durch Blau-
  Weiß-Selektion

Unter „cross-linking“ (zu deutsch: „vernetzen“) versteht man das kovalente Binden von Proteinen an andere Biomoleküle, mit denen das spezifische Protein im Organismus interagiert.

Diese Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen findet vor allem
Verwendung für den Nachweis von transient bindenden Protein-Komplexen, bei denen
die Dauer der Interaktion nur kurzweilig ist.

Proteine, im Moment ihrer Interaktion, kovalent miteinander gebunden.

Cross-linker sind selbstständige Moleküle mit reaktiven Gruppen, welche mit den Aminosäure-Seitenketten reagieren.

• Homo- und Heterobifunktionelle CL
  weisen dieselben (homo) bzw. verschiedene (hetero) reaktive Gruppen an den Enden auf
• Cleavable-CL
  zB Disulfid-bond, lassen sich nach Zugabe gewisser Reagentien, wieder trennen (hier: Disulfid-bond wird aufgelöst) Danach kann prey-Protein einzeln untersucht werden.
• Photoreaktive cross-linker
  wichtigste Gruppe von CL, heterobifunktionelle cross-linker, die eine reaktive Gruppe
  am einen Ende und eine Photoaffinitäts-Gruppe, am anderen Ende besitzen. Letztere
  ist eine reaktive Gruppe deren „Aktivität“ erst mit Einwirkung von UV-Licht ermöglicht wird.

Diese Art des cross-linkens läuft in 2 Schritten ab:

1. Zuerst reagiert der CL mit einer der funktionellen Gruppen des zu untersuchenden Proteins. Ein sogenannter Photoaffinitäts-Ligand (PAL) entsteht. (Dabei ist entweder Protein oder CL radioaktiv markiert)
2. Der PAL wird gereinigt und in ein Zellmedium zugegeben, inkubiert und mit UVLicht bestrahlt. Die gebildeten Komplexe werden mithilfe verschiedener Methoden analysiert.

• falsch-positive Ergebnisse, da cross-linker auch „falsche“ Proteine binden können
• CL können die Funktion von Proteinen (zer-)stören
• bei in vitro Untersuchungen können sich Proteine anders als in vivo verhalten

Diese macht sich die Antigen-Antikörper-Reaktion zu Nutze, um Proteine, die an einen
spezifischen Antikörper binden, mittels beispielsweise Western Blot zu charakterisieren.

Die Abfolge einer IP:

• Lyse einer Zelle
• Proteine mit proteinspezifischen Antikörpern, Trägern - sogenannten Beads - und Protein A-, B- oder L-Agarose versetzt.
• Immun-Komplex, Antigen (Protein) und Antikörper, findet zusammen, und der Antikörper wird durch die Anbindung an die A-, G-Protein Beads immobilisiert.
• Dadurch ist der Komplex verbunden und kann mittels einer Durchspülung von den restlichen Proteinen getrennt werden.
• Der gebundene Komplex kann, nachdem er wieder durch Änderung des pH oder Ionenstärke des Puffers vom Träger abgelöst wurde, mittels Western Blotting oder vergleichbarer Verfahren auf die Größe der Moleküle charakterisiert werden.

Durch diese Analyse lassen sich die vielen spezifischen Aufgaben eines Proteins näher untersuchen, wie zum Beispiel seine spezifische enzymatische Aktivität, oder um eine Protein-Protein Interaktion zu erkennen.