10 a Praktikum - Bakteriologie

Bei den meisten prokaryotischen Zellen liegt die DNA als ein ringförmiges Molekül vor. Dieses Bakterienchromosom aggregiert und bildet innerhalb der Zelle eine Masse, das so genannte Nucleoid. Die meisten Prokaryoten besitzen nur ein einziges Chromosom und nur eine Kopie jedes Gens. Viele Prokaryoten enthalten auch geringe Mengen ringförmiger DNA, die sich von der des Chromosoms unterscheidet, die Plasmide. Plasmide enthalten im Allgemeinen Gene, die eine besondere Eigenschaft auf eine Zelle übertragen.

Es werden zwei Arten von Kulturmedien verwendet:

- Definierte Medien werden hergestellt, indem man genaue Mengen hoch gereinigter anorganischer oder organischer Substanzen zu destilliertem Wasser gibt.

- Komplexe Medien enthalten Abbauprodukte von tierischen und pflanzlichen Produkten wie Casein, Rindfleisch, Hefezellen oder eine von vielen anderen nährstoffreichen aber unreinen Substanzen.

Feste Kulturmedien werden nach den gleichen Methoden zubereitet wie flüssige Medien, nur fügt man vor der Sterilisation Agar hinzu, ein Verfestigungsmittel. Feste Kulturmedien immobilisieren Zellen, so dass sie wachsen können und erkennbare, isolierte Anhäufungen, Kolonien, bilden.

1. Anlaufphase (lag-Phase). In der lag-Phase passt sich der Stoffwechsel der Bakterien an die Bedingungen des umgebenden Nährmediums an. Nährstoffe aus dem Medium werden aufgenommen und die für die Verarbeitung notwendigen Enzyme hergestellt. Es kommt noch nicht zu einer Teilung der Zellen, sondern nur zu einer Vermehrung ihres Volumens.
2. Exponentielle Wachstumsphase (log-Phase). Die Bakterien teilen sich in regelmässigen Abständen und die Zellzahl nimmt exponentiell zu. Das bedeutet, dass es nicht zu einem stetigen, linearen Wachstum kommt. Vielmehr vermehren sich die Bakterien in kurzer Zeit sehr stark.
3. Stationäre Phase. Nach einer Weile sind die Nährstoffe im Medium erschöpft, und es haben sich giftige Stoffwechselprodukte der Bakterien im Nährmedium angesammelt. Die Bakterien unterbrechen ihre Wachstumsvorgänge, die Zellteilungen werden eingestellt und die Zellzahl nimmt nicht weiter zu.
4. Absterbephase. In der Absterbephase können fehlende Nährstoffe den Energiebedarf der ruhenden, stationären
Bakterien nicht mehr decken. Giftige Stoffwechselprodukte im
Nährmedium behindern den Zellstoffwechsel. Es setzen Absterbevorgänge ein und es kommt zum fortschreitenden Untergang von Bakterienzellen.

Das Wachstum einer Bakterienkultur verläuft nicht linear wie das eines Haares. Anzahl und Biomasse der Bakterien nehmen exponentiell zu, nämlich mit jeder Generation um den Faktor zwei (21, 22, …). Die Wachstumskurve beschreibt die Zellzahl als Funktion der Zeit oder der Anzahl Zellteilungen pro Bakterium.

Methode zur Ermittlung der Gesamtzellzahl einer mikrobiellen Kultur ist die direkte, mikroskopische Auszählung der Zellen in einer Zählkammer. Solche Zählkammern existieren in verschiedenen Ausführungen und viele der verschiedenen Zählkammertypen wurden ursprünglich zur Zählung von Blutzellen entwickelt, z.B. Neubauer-Zählkammer oder Thoma-Zählkammer. Die Gesamtzellzahl kann auch mittels Photometrie bestimmt werden. Hier nutzt man die Eigenschaft von Suspensionen, dass diese Licht streuen. Daher spricht man auch von Trübungsmessung oder Turbidimetrie. Dazu strahlt man monochromatisches Licht einer Wellenläge zwischen 540 und 600 nm durch die zu untersuchende Probensuspension und misst die Intensitätsschwächung des eingestrahlten Lichtes. Dabei wird die Lichtabsorption vernachlässigt. Der erhaltene Wert wird als dimensionslose optische Dichte (OD) bezeichnet.

Zur Ermittlung der Lebendzellzahl einer mikrobiellen Kultur kommen das Gussplattenverfahren nach Koch oder das Spatelplattenverfahren zur Anwendung. Dazu muss die Ausgangssuspension zunächst unter kontaminationsfreien Bedingungen verdünnt werden. Anschliessend werden bei beiden Verfahren die verdünnten Zellsuspensionen auf festen Nähragarböden ausgebracht und inkubiert. Beim Gussplattenverfahren wird die Probe unter den noch flüssigen Agar gemischt, mit diesem in eine Petrischale ausgegossen und erstarrt. Beim Spatelplattenverfahren dagegen wird die Probe auf der Oberfläche der Nähragarplatte aufgebracht und gut mit einem Drigalski-Spatel (Plastikspatel) verteilt. Zuletzt zählt man die gebildeten Kolonien auf den Platten aus und errechnet unter Berücksichtigung der Verdünnung die Zellzahl pro Volumen. Bei der Ermittlung der Lebendzellzahl wird oft von Koloniebildenden Einheiten (KbE) gesprochen oder auf Englisch Colony Forming Units (CFU).

Streptomycin und andere Aminoglykoside hemmen die Initiation und verursachen Fehlablesungen der mRNA (bei Prokaryoten)

Tetracyclin lagert sich an die 30S-Untereinheit an und hemmt die Bindung der Aminoacyl-tRNAs (bei Prokaryoten)

Chloramphenicol hemmt die Peptidyltransferaseaktivität der 50S-Ribosomenuntereinheit (bei Prokaryoten)

hemmt die Peptidyltransferaseaktivität der 60S-Ribosomenuntereinheit (bei Eukaryoten!, deshalb kein Antibiotikum im herkömmlichen Sinn)

Erythromycin lagert sich an die 50S-Untereinheit an und hemmt die Translokation (bei Prokaryoten)

Puromycin verursacht vorzeitigen Kettenabbruch, weil es als Analogon der Aminoacyl-tRNA wirkt (bei Prokaryoten und Eukaryoten)

Penicilline greifen im Bereich der Zellteilung in den Stoffwechsel der Bakterien ein und blockieren die Synthese der bakteriellen Zellwand:
Der Beta-Lactam-Ring der meisten Penicillin-Antibiotika öffnet sich im Zytosol des exponierten Bakteriums und bindet in der geöffneten Form an das bakterielle Enzym D-Alanin-Transpeptidase. Auf diese Weise kann dieses Enzym nicht mehr die Alaninreste der Zellwand verknüpfen, das befallene Bakterium stirbt dadurch schließlich ab.

Die bakteriolytische Wirkung von Ampicillin setzt nach der Teilung von Bakterien ein. Sie beruht, wie bei allen β-Lactam-Antibiotika, auf der Blockierung des für Ausbildung einer neuen Mureinschicht notwendigen Enzyms D-Alanin-Transpeptidase. Ampicillin verhindert also die Neusynthese einer stabilen Zellwand. Die Teilung menschlicher Zellen wird nicht behindert, da menschliche Zellen keine Mureinschicht enthalten.

Sterilisation = Entkeimung
Desinfektion = Keimreduktion
Pasteurisation =Erwärmung und Abtöten von Mikroorganismen -> haltbarmachung